大家好！今天跟大家分享一篇我們課題組最近發(fā)表在Angewandte Chemie International Edition的文章，題目為 “DNA Nanolithography Enables Highly Ordered Recognition Interface in Microfluidic Chip for Efficient Capture and Release of Circulating Tumor Cells”。作者設(shè)計(jì)了一個(gè)頂點(diǎn)懸垂核酸適體的四面體DNA納米結(jié)構(gòu)，其作為具有納米精度的識(shí)別元件，可通過化學(xué)修飾的方法錨定到確定性側(cè)向位移(DLD)模式的微流控芯片上，然后實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的高效捕獲和釋放，并通過數(shù)字液滴PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行下游基因突變分析。

【背景介紹】

隨著微加工技術(shù)的發(fā)展，微流體技術(shù)的應(yīng)用取得了重大的進(jìn)展。納米級(jí)微流控芯片展示出巨大的應(yīng)用潛力，納米-微米結(jié)構(gòu)構(gòu)筑的跨尺度界面，可不受傳質(zhì)阻力的限制，從而改善界面上分子識(shí)別的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)。盡管已經(jīng)開發(fā)出多種用于微米級(jí)結(jié)構(gòu)的制造方法，但可重復(fù)地制備具有高精度尺寸的納米級(jí)結(jié)構(gòu)在技術(shù)上仍然具有挑戰(zhàn)性。例如電子束光刻和納米壓印技術(shù)等雖可制備高分辨率納米結(jié)構(gòu)但由于依賴大型昂貴設(shè)備及多步處理步驟，限制了其廣泛應(yīng)用。

核酸適體是一條單鏈的DNA或RNA，能自發(fā)折疊成特異的三維結(jié)構(gòu)以實(shí)現(xiàn)高親和力、高特異性識(shí)別靶標(biāo)分子。與抗體相比，核酸適體用于CTC分析，顯示出許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如良好的物理穩(wěn)定性、低成本、易于改造修飾且批次間差異很小。目前已開發(fā)核酸適體的CTC微流控體系，大多是通過物理吸附、化學(xué)反應(yīng)或生物分子識(shí)別將核酸適體連接到基質(zhì)界面。然而，核酸適體的結(jié)構(gòu)會(huì)受到鏈間纏繞以及適體與芯片界面之間非特異性相互作用的影響，在很大程度上限制了核酸適體對(duì)CTCs上所表達(dá)標(biāo)志物的識(shí)別作用，致使目前適體微流控芯片對(duì)CTC捕獲效果不理想。

DNA分子由于其精確和可編程的核苷酸堿基配對(duì)原則，可以精準(zhǔn)組裝成多種形狀、大小和尺寸的DNA納米結(jié)構(gòu)。其中，四面體DNA納米結(jié)構(gòu)（TDN）可作為定向修飾識(shí)別分子的剛性框架，有望作為功能分子和微流控界面之間的橋梁，避免常規(guī)微流控界面上核酸適體修飾產(chǎn)生的不良取向或擁擠效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)功能分子的均勻垂直界面修飾。

 【設(shè)計(jì)思路】

作者首先設(shè)計(jì)了一個(gè)頂點(diǎn)懸垂核酸適體SYL3C(針對(duì)CTCs標(biāo)志物上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM)）的四面體DNA納米結(jié)構(gòu)（SYL3C-TDN），然后通過化學(xué)修飾的方法錨定到確定性側(cè)向位移(DLD)模式的微流控芯片(ApTDN-Chip)上 (如圖1)。剛性的四面體DNA框架通過“DNA納米光刻”，可實(shí)現(xiàn)核酸適體呈高度有序且直立的納米形貌排布，有利于適體對(duì)CTC的識(shí)別作用。而DLD芯片通過尺寸選擇，可提高CTC與微柱之間的碰撞效率，同時(shí)最大程度地減少血細(xì)胞與微柱之間的碰撞。此外，四面體DNA支架還通過在界面上合理的空間間距降低了核酸適體的局部擁擠效應(yīng)，使DNA核酸酶(DNaseⅠ)更易于與核酸適體作用，從而實(shí)現(xiàn)捕獲后細(xì)胞的有效釋放。最后可利用數(shù)字液滴PCR技術(shù)對(duì)釋放的CTC開展下游分子生物學(xué)分析。

圖1. ApTDN-Chip的工作原理

【數(shù)據(jù)介紹】

SYL3C-TDN由一條含有核酸適體SYL3C片段的DNA長鏈（Apt-A）和三條DNA單鏈一步合成得到，與TDN有相似的高產(chǎn)率（超過85%），且重現(xiàn)性好。如圖2A、B所示，SYL3C-TDN 能夠維持核酸適體SYL3C特異性識(shí)別EpCAM表達(dá)陽性的SW480細(xì)胞系的能力，同時(shí)避免非特異性吸附。為了驗(yàn)證TDN作為納米支架在界面上的優(yōu)勢(shì)，作者將不同濃度的SYL3C-TDN和SYL3C通過鏈霉親和素和生物素作用修飾到磁珠上，然后投入相同數(shù)量的SW480細(xì)胞系。通過分析靶細(xì)胞的回收率，可以得到界面上SYL3C-TDN的平衡解離常數(shù)（K_d）為7.11 ± 0.98 nM（圖2D），相比于界面上SYL3C的親和能力降低了4倍（K_d=30.46 ± 3.20 nM，圖2C）。此外，在均相溶液中，SYL3C-TDN表現(xiàn)出與SYL3C相似的親和能力。由此可見，四面體DNA支架能夠提高核酸適體在界面上的識(shí)別熱力學(xué)。

圖2. SYL3C-TDN識(shí)別能力的探究

為了進(jìn)一步探究微流控芯片中DNA納米界面對(duì)于提高細(xì)胞捕獲效率的作用，作者設(shè)計(jì)了四種不同類型的微納界面（圖3A）。其中，生物素標(biāo)記的DNA通過鏈霉親和素修飾到微流體界面是常用的芯片修飾策略。然而，鏈霉親和素以無序的形式隨機(jī)固定在微流體界面上，使得DNA以一個(gè)取向雜亂的狀態(tài)存在，這大大降低了DNA分子識(shí)別效率。而TDN作為分子支架，為核酸適體提供直立的取向和可控的間距，使得ApTDN-Chip展示出較高的捕獲效率（在緩沖液中87.4%），與另外三種微納米界面相比，捕獲效率提高了20-60%（圖3B）。此外，ApTDN-Chip在模擬病人血樣中仍保持較高的捕獲效率。同時(shí)，ApTDN-Chip對(duì)于白細(xì)胞和EpCAM表達(dá)陰性的Ramos細(xì)胞系的非特異性吸附與另外三種微納米界面是相似的（圖3B、C）。

圖3.核酸適體不同微納米界面修飾的性能探究

高效無損釋放CTCs對(duì)于下游分析十分重要。近年來，研究人員開發(fā)了多種用于核酸適體的微流控芯片的釋放方案，如熱裂解、互補(bǔ)序列雜交和核酸酶水解。然而，它們的釋放效率往往會(huì)因?yàn)榻缑嫔暇植繐頂D效應(yīng)或識(shí)別分子和界面的非特異性吸附，難以達(dá)到理想效果?；诖?，四面體DNA支架為SYL3C-TDN在界面上提供合理的空間間距，能減小局部分子擁擠效應(yīng)，使得DNaseⅠ更好的水解DNA序列。如圖4A，ApTDN-Chip中捕獲后的腫瘤細(xì)胞幾乎80%會(huì)被釋放，比Apt-Chip的釋放效率高約30%。這一釋放策略是通過水解核酸適體實(shí)現(xiàn)靶細(xì)胞的釋放，因而非特異性吸附的白細(xì)胞大部分仍留在微通道表面，使得釋放后CTCs的純度能夠進(jìn)一步提升（圖4C）。此外，如圖4D、E所示，釋放后的細(xì)胞活性仍保持較高的水平（90.8%），有利于后續(xù)下游分子生物學(xué)分析。

CTC攜帶突變基因信息，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中是一個(gè)潛在的生物標(biāo)記物，例如一些對(duì)表皮生長因子受體（EGFR）抗體治療產(chǎn)生耐藥性的病人往往會(huì)存在KRAS基因突變，而隨著腫瘤的發(fā)展，KRAS突變也會(huì)隨之發(fā)生改變。因此，作者通過數(shù)字液滴PCR技術(shù)可對(duì)回收后的CTCs進(jìn)行KRAS突變檢測。模擬病人樣本驗(yàn)證ApTDN-Chip的捕獲-釋放策略，可檢測出低至每毫升20個(gè) SW480細(xì)胞所攜帶的KRAS基因突變信息，檢測出每微升15.4的拷貝數(shù)（圖4F、G）。此外，ApTDN-Chip技術(shù)也被應(yīng)用于病人外周血CTC捕獲及下游KRAS基因突變檢測，突變檢測結(jié)果和臨床組織穿刺結(jié)果具有良好的一致性。

圖4. ApTDN-Chip下游分析探究

【總結(jié)】

本文展示了“DNA納米光刻”用于構(gòu)建有序微流控芯片識(shí)別界面的潛力。剛性的四面體DNA支架為核酸適體提供高度有序的直立方向和可控間距，從而促進(jìn)核酸適體在界面的有效識(shí)別。與傳統(tǒng)的納米級(jí)微流控界面加工方法相比，該平臺(tái)易于制造并表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。這種具有高精度尺寸的納米級(jí)框架結(jié)構(gòu)作為識(shí)別分子和微流控界面之間的橋梁，改善了識(shí)別分子在界面修飾上的分子識(shí)別的熱力學(xué)。利用“DNA納米光刻”實(shí)現(xiàn)微流控界面功能化有望用于許多領(lǐng)域，如無創(chuàng)產(chǎn)前檢測、循環(huán)腫瘤外泌體和各種生物標(biāo)記物的檢測以及細(xì)胞行為調(diào)控。

該工作由課題組和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院胃腸外科聯(lián)合攻關(guān)完成。2018級(jí)碩士研究生張佳露為論文的第一作者，宋彥齡、楊朝勇及胃腸外科趙剛為本文共同通訊作者。
撰稿人：張佳露（碩士生）

校稿：宋 佳

原文鏈接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202005974

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