微流控芯片可將樣品預(yù)處理、目標(biāo)物分選以及檢測等多個功能集成到一塊芯片上，以流體和陣列多通道的形式縮短分析時間，為大規(guī)模高通量生物分析提供高效的實驗和檢測技術(shù)平臺。微流控芯片具有高度的自由定制性及可操作性，若將SERS技術(shù)與微流控芯片技術(shù)結(jié)合，即可獲得自動化的微流控SERS檢測芯片。SERS效應(yīng)的產(chǎn)生極度依賴于SERS增強基底。因此，微流控SERS檢測芯片的一大關(guān)鍵是將SERS基底引入芯片中。根據(jù)芯片上SERS基底的類型可以將微流控SERS檢測芯片(SERS-LoC)簡單地分為三種：液態(tài)、固態(tài)及原位生長基底芯片。

液態(tài)基底是最早在微流控SERS檢測芯片中使用的基底。這種基底的操作方法簡單，并且可以直接利用微流中液體流動的特性進行散熱，從而避免大功率激光對待測分子造成的光熱損傷。最簡單的方法是直接將制備好的金屬納米粒子通入微流通道內(nèi)作為SERS檢測的基底。如圖 8(a)，將銀膠通入微流通道內(nèi)時，銀膠與修飾拉曼分子的DNA連接，形成基底-拉曼分子結(jié)構(gòu)，最終落在SERS檢測區(qū)進行檢測。液態(tài)的SERS基底最顯著的優(yōu)點是可以在微流芯片內(nèi)流動，從而與拉曼分子充分混合。類似的還有圖 8(b)中的研究，都是將制備好的金屬納米粒子通入微流通道。在微流控芯片內(nèi)進行實驗，其反應(yīng)微環(huán)境相對可控，增加了實驗的可靠性并能在一定程度上可以提高檢測的靈敏度。此外，另一種液態(tài)基底利用微流控芯片良好的操控性，控制納米粒子流動并讓其聚集在理想的區(qū)域或者形成規(guī)則密集的聚集體。這些可控的納米粒子聚集體可以提供大量的SERS熱點，因而更有效地增強拉曼信號。目前，這種將流入芯片的納米粒子捕獲在一定區(qū)域，并控制納米粒子的形貌、濃度等特征，使其形成納米聚集體成為了液態(tài)基底的又一研究方向。如圖 8(c)，在PDMS芯片上設(shè)置一個氣閥，通過壓力控制擠壓其變形，從而阻止金納米粒子通過而聚集在SERS檢測區(qū)形成聚集體。在檢測完畢后釋放壓力使芯片恢復(fù)，則金納米粒子可以通過并被清洗掉。然而，這種基于阻塞流通的聚集體形成方法對納米粒子的形貌要求較高，且形成速度較慢。圖 8(d)給出了另一種可控納米聚集體的形成方法。Hyundoo等人設(shè)計了三層的微流控平臺：透明電極上的光導(dǎo)層、液體空腔及接地電極。當(dāng)光導(dǎo)層被電磁激發(fā)時，電流通過光照區(qū)域在空腔內(nèi)形成一個不均勻的電場，致使金屬納米粒子集中起來形成一個聚集體。并且通過改變光照區(qū)域可以在不同位置形成SERS基底。這一巧妙的設(shè)計可以很方便的將最簡單的納米粒子聚集在微流芯片上形成需要的聚集體作為基底使SERS信號得到極大增強。

圖 8 (a) 集成DNA競爭取代序列檢測的SERRS微流微系統(tǒng)。修飾DNA探針-報告分子對的二氧化硅微球(插圖)充滿一個區(qū)塊。當(dāng)目標(biāo)序列引入到入口時，拉曼分子的鏈被取代。它們沿著通道流動時與金屬納米聚集體混合并被捕獲在微流芯片中的SERRS檢測區(qū)域。(b)A：基于SERS競爭吸附免疫檢測的螺旋線雙通道微流傳感器示意圖。傳感器由兩個平行的通道組成：一個檢測PGA(淺灰)，另一個作對照(深灰)。B：注滿四種不同顏色墨水的芯片圖像。C：磁性免疫檢測的捕獲區(qū)域圖。(c)用帶氣閥的通道捕獲與釋放金納米粒子進行SERS檢測的示意圖。(d)光電微流SERS光譜。

小量樣品的光電微流設(shè)備集成到一個傳統(tǒng)的SERS檢測系統(tǒng)。用一個激光光源可以同時達到使金屬納米粒子聚集和SERS信號的檢測的目的在微流芯片內(nèi)引入液態(tài)基底的方法簡單方便，但液態(tài)基底的顯著問題是液體的流動性導(dǎo)致基底形貌不均勻，進而使其產(chǎn)生的熱點分布不均衡。后果是同一批次實驗通道內(nèi)不同位置的SERS信號強度差異較大，均一性不好。

雖然研究者提出了可重復(fù)性的基底作為改進，但能更好的解決這一問題的方案就是使用固態(tài)的SERS基底。近年來，由于制作工藝發(fā)展突飛猛進，許多應(yīng)用在PDMS上的固態(tài)基底研究被報道出來。如圖 9(a)，Young等人先用熱蒸發(fā)法在PDMS上鍍一層銀，再用氧等離子處理后與玻璃鍵合形成微流通道。同時氧等離子體處理后可以在平展的銀表面生成一些粗糙的微結(jié)構(gòu)以增加熱點而增強SERS信號。在這些精心設(shè)計的SERS基底中，一些3D等離子體的結(jié)構(gòu)由于其大面積可吸附分析物的性質(zhì)吸引了很多研究者的注意。如圖 9(b)，在柱形硅陣列上濺射一層薄薄的銀后形成一種被稱為納米柱森林(nanopillar forest)的基底結(jié)構(gòu)被應(yīng)用在微流芯片內(nèi)。這一結(jié)構(gòu)最突出的特點是其良好的可重復(fù)性，據(jù)報道在檢測時相對誤差只有13%。

圖 9 (a) 光流控芯片的制做流程；(b)納米柱森林的制造流程及其SEM圖

此外，還有一類微流控芯片直接在微流芯片內(nèi)部實現(xiàn)基底的制備并用于檢測，被稱作原位(in situ)生長的SERS基底。如圖 10(a)，Xu B B等人用飛秒激光器引導(dǎo)光致還原，在通道內(nèi)生成銀微花形結(jié)構(gòu)陣列，每一個單體的表面都非常粗糙，以此為基底可以產(chǎn)生很強的SERS增強效果。類似的，Yan W等人在微流內(nèi)利用光化學(xué)還原銀納米聚集體，并發(fā)現(xiàn)在第一次光照還原生成納米粒子后將其洗去接著第二次在相同的激光下再次生成大量細小的銀納米粒子，這一關(guān)鍵的步驟直接導(dǎo)致在通道內(nèi)產(chǎn)生了大量的熱點，而使得在檢測SERS信號時可以增強一個數(shù)量級(圖 10(b))。

圖 10 (a) 在微流芯片內(nèi)激光制造SMA的示意圖；(b)A：微流芯片內(nèi)三個模塊示意圖，分別用紅、綠和藍色方塊表示注射、混合和光學(xué)檢測功能區(qū)。B：光引導(dǎo)銀納米聚集體的形成過程及原位SERS檢測。注射區(qū)的硝酸銀、水、CV和檸檬酸鈉溶液用不同顏色表示。

微流通道內(nèi)的流動用白色箭頭指示隨著微流芯片內(nèi)SERS基底制備技術(shù)的不斷改進與優(yōu)化，SERS信號的靈敏度、特異性和可重復(fù)性得到了進一步的改善。微流控芯片與SERS技術(shù)二者的協(xié)同作用使得SERS-微流芯片(SERS-LoC)的應(yīng)用越來越廣泛。

生物檢測

SERS的特異性與無損特性使其非常適合生物醫(yī)學(xué)方面的研究。再加上微流芯片的穩(wěn)定性、靈活性與微量樣品檢測的特性，目前，SERS-LoC的生物檢測應(yīng)用取得了不少突出的進展。

與在溶液中類似的檢測原理，在微流控芯片中也可以利用SERS光譜來進行生物標(biāo)志物的檢測。miRNA是一種控制基因表達的非編碼RNA，參與了生物體的很多過程。Novara C等人在微流芯片上制作了兩種SERS基底(圖 11(a))，分別檢測帶拉曼標(biāo)記的miRNA和無標(biāo)記的miRNA[58]?？乖鳛樽钪匾哪[瘤標(biāo)志物之一也被引入到SERS微流芯片中。

Gao R等人制作了液滴的微流系統(tǒng)(圖 11(b))，將磁球作為捕獲基底，同時加入待測物PSA和SERS探針后在微流內(nèi)充分混合。最后用磁鐵將反應(yīng)生成的磁球-PSA-探針免疫復(fù)合物分離，通過檢測通道內(nèi)剩余探針的SERS信號來反映待測物的濃度。微流控芯片的一大優(yōu)勢是可以模擬體液流動環(huán)境，這給識別并收集體內(nèi)的循環(huán)腫瘤細胞(CTC)提供了研究平臺。Pallaoro Alessia等人在微流通道內(nèi)注入腫瘤細胞與正常細胞的混合液并使其排成一列流動(圖 11(c))，通過激光照射區(qū)域得到SERS信號并利用兩種分析方法即主成分分析(PCA)和最小二乘法進行分析。除了直接對細胞進行識別和分析，檢測細胞分泌物作為研究細胞間通信的基礎(chǔ)也是生物檢測分析的一大課題。我們也提出了一種SERS微流芯片內(nèi)用于實時監(jiān)測細胞間通信的方法(圖 11(d))。該芯片結(jié)合了SERS光譜編碼技術(shù)與蛋白質(zhì)陣列的空間編碼技術(shù)，將大量待測樣品中蛋白質(zhì)的種類和含量信息加載到基于SERS的三維碼中，只需通過三維碼的解碼即可獲取所有樣品中各種蛋白質(zhì)的含量信息，該檢測平臺具有信息量大、檢測靈敏度高(～10 fg/mL)、響應(yīng)速度快(30 min)、操作簡便等優(yōu)點。

圖 11 (a) 在硅片上修飾銀納米粒子作為基底集成在微流芯片上，A：一步法，B：兩步法檢測miRNA；(b)基于SERS的液滴微流傳感器免清洗的磁性免疫檢測示意圖。這種傳感器由5個部分組成，功能如下：ⅰ液滴生成及試劑混合；ⅱ形成磁性免疫復(fù)合物；ⅲ磁鐵分離免疫復(fù)合物；ⅳ含有上清的更大的液滴生成來進行SERS檢測；ⅴ含有磁性免疫復(fù)合物的更小的液滴生成；(c)微流芯片構(gòu)成及概念示意圖。細胞預(yù)先標(biāo)記腫瘤特異性與對照探針(后者兩種細胞都有修飾)，再注入芯片中，流向中心匯集后通過拉曼激光照射；(d)微流芯片示意圖：A：頂視圖B：側(cè)視圖。這一設(shè)備有兩層：液體流動層(黑線)和調(diào)節(jié)流動層連接的控制層(粉色和藍色圖案)。在側(cè)視圖中芯片由3個功能區(qū)域組成。區(qū)域Ⅰ：細胞培養(yǎng)池(癌細胞)；區(qū)域Ⅱ：抗體條碼(不同通道內(nèi)基底與抗體相匹配)；區(qū)域Ⅲ：細胞培養(yǎng)池(免疫細胞被基底上的抗體捕獲)

離子檢測

小分子或離子的檢測要求檢測方法具有優(yōu)異的可靠性與靈敏度。SERS-LoC的一系列優(yōu)秀的特性使其成為檢測小分子或離子的非常有力的工具。

硫氰酸離子作為評價人體健康的重要標(biāo)記分子廣泛存在于體液中，檢測體內(nèi)硫氰酸離子的濃度對臨床診斷與疾病預(yù)防很有意義。砷作為一種環(huán)境中普遍存在的污染物影響著人們的健康，圖 12(a)中展示了一種間接檢測砷離子的策略[64]。Nan等人將銀納米粒子修飾谷胱甘肽(GSH)和拉曼分子作為探針，在之字形微流通道內(nèi)使砷離子與探針充分混合，其中砷離子與谷胱甘肽結(jié)合可以導(dǎo)致銀粒子的聚集從而增強SERS信號。這種方法可以檢測低至6.7×10-10g/mL的砷離子。我們設(shè)計了一種液滴SERS微流控系統(tǒng)，將樣品與銀殼金納米棒混合形成液滴在通道內(nèi)流動并進行快速的SERS檢測(圖 12(b))。這種方法在人血清中檢測動態(tài)范圍達到4到256 μM并可以實現(xiàn)真實唾液樣本的檢測。

圖 12 (a) A：用來檢測砷離子的微流芯片示意圖。砷離子與GSH/4-MPY修飾的納米粒子在之字形微流通道內(nèi)快速、充分混合(插圖)。B：砷離子的分析原理。當(dāng)砷離子與GSH/4-MPY修飾的納米粒子耦合時發(fā)生聚集，銀納米粒子上的4-MPY的拉曼信號被增強；(b)A：液滴微流設(shè)備的示意圖。B：銀殼金納米棒的SERS光譜(紅色)及加入硫氰酸離子后的SERS光譜(藍色)

便攜的SERS-LoC

利用高集成度的芯片可以在一塊芯片上完成整個復(fù)雜的實驗，使得微流芯片直接代替了實驗室的環(huán)境，微小的尺寸使其有很好的便攜性，可在任意地方進行實驗。然而對于SERS而言，由于檢測時需要光學(xué)校準(zhǔn)和對焦等復(fù)雜過程，將SERS-LoC做成便攜的設(shè)備成為不小的挑戰(zhàn)。近來，光流控(optofluidic)的發(fā)展解決了這一困難[66]。如圖 13(a)，Soroush等人將光纖元件集成到微流芯片上消除了SERS檢測時光學(xué)對焦等負擔(dān)[67]，使現(xiàn)場(on-site)SERS檢測成為可能。除此之外，手持的拉曼光譜儀也可以用來實現(xiàn)SERS的現(xiàn)場分析[68]。圖 13(b)顯示了Kim等人提出的將芯片內(nèi)的納米柱陣列作為SERS基底，運用手掌大小的便攜拉曼光譜儀進行在現(xiàn)場的SERS檢測牛奶中的三聚氰胺[69]。這種簡便的拉曼光譜儀并沒有降低檢測靈敏度，實驗在水溶液中檢測限達到1.2×10-10 g/mL，而在奶粉提取物中檢測限為1.0×10-10 g/mL，均達到了FDA要求的標(biāo)準(zhǔn)。隨著更多簡易方便的平臺被研究出來[70]，為現(xiàn)場SERS檢測而準(zhǔn)備的便攜設(shè)備越來越成熟。

圖 13 (a) A：光流控SERS微系統(tǒng)示意圖。B：光流控SERS系統(tǒng)。C：充滿的微球和集成的光纖；(b)牛奶中三聚氰胺檢測的比較使用A：標(biāo)準(zhǔn)的FDA過程和B：我們的納米柱檢測方案。在顯示金納米柱芯片用于分子檢測同時展示的具有代表性的SEM圖為打開(左)和關(guān)閉(右)的金納米柱五聚物分別對應(yīng)處理過濾的牛奶前后

結(jié)束語

綜上所述，本文簡單介紹了SERS的原理，著重從基底的設(shè)計上敘述了SERS的發(fā)展。接下來總結(jié)了幾種SERS在生物傳感中的應(yīng)用，主要從SERS探針的制備和不同待測物的檢測兩方面進行概述。通過將SERS基底引入到微流芯片內(nèi)形成微流控SERS檢測芯片(SERS-LoC)。在微流控SERS檢測芯片中，無論是液態(tài)、固態(tài)還是原位生長的SERS基底都有其特點及應(yīng)用背景。最后，我們討論了目前微流控SERS檢測芯片的幾種應(yīng)用。檢測的分析物有DNA、抗原、生物標(biāo)志物、細胞、汞離子、砷離子等。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展SERS-LoC系統(tǒng)也逐漸趨于便攜性，出現(xiàn)了手持的設(shè)備，為真正的on-site現(xiàn)場檢測提供了有力幫助。

盡管微流控SERS檢測芯片已經(jīng)取得了引人注目的研究進展，然而檢測特異性與可重復(fù)性、芯片的多功能化與集成度的提高等依舊是微流控SERS檢測芯片今后的研究目標(biāo)。尤其是如何直接使用實際臨床生物樣本進行目標(biāo)物的檢測。實際臨床樣品(如病人的血液)很復(fù)雜，它們往往含有豐富的蛋白質(zhì)、DNA等。這些生物大分子在SERS檢測的過程中都有可能提供非特異性的噪聲信號，從而造成假陽性或假陰性的檢測結(jié)果，嚴(yán)重影響檢測結(jié)果的可靠性。

因此，對于實際樣品來說，微流控SERS檢測芯片的特異性問題尤為重要。通常，解決微流控SERS檢測芯片的特異性問題可從兩點出發(fā)。首先，優(yōu)化SERS基底或探針的生物功能化修飾，提高基底或探針識別待測物的選擇性和準(zhǔn)確性；其次，在微流芯片內(nèi)增加可對待測物進行篩選的功能單元，例如物理尺寸篩選或化學(xué)配體識別篩選，盡可能地排除其他物質(zhì)的非特異性干擾。若微流控SERS檢測芯片能夠?qū)嶋H的復(fù)雜生物樣品進行高準(zhǔn)確性地測試，則必將極大地推進微流控SERS檢測芯片在臨床診斷與治療中的應(yīng)用。此外，低成本的自動化微流控SERS檢測芯片也是今后人們研究的重點目標(biāo)之一。其關(guān)鍵是如何在保證完善的傳感與分析功能的前提下，盡可能降低芯片的制作成本。低成本的微流控SERS芯片對于欠發(fā)達地區(qū)的生化檢測(如疾病普查、環(huán)境監(jiān)測等)具有非常重要的社會價值與現(xiàn)實意義。在將來，SERS與微流控芯片技術(shù)進一步發(fā)展，如將激光、光譜儀等設(shè)備集成到芯片上后會更大程度上發(fā)揮SERS-LoC的作用，為現(xiàn)場實時檢測技術(shù)的完善作出巨大貢獻，屆時生命健康科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等方面會極大受益?？梢灶A(yù)見的是，隨著功能的不斷完善和性能的不斷提高，集成的、自動化的SERS-LoC芯片必然會成為生物傳感檢測領(lǐng)域中一項非常重要的技術(shù)。

文獻來源中國光學(xué)DOI: 10.3788/CO.20181103.0513

作者：王志樂, 王著元, 宗慎飛, 崔一平

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