微生物是工業(yè)生物技術(shù)的核心與基礎(chǔ)。利用先進(jìn)的現(xiàn)代自動(dòng)化和儀器分析技術(shù)開(kāi)發(fā)的高通量篩選平臺(tái)，具有自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化、高通量化等特征，大大突破了人工篩選在速度、效率和標(biāo)準(zhǔn)化等方面的限制，是微生物菌種篩選的一次技術(shù)革命。然而，已經(jīng)投入使用的各類(lèi)高通量篩選系統(tǒng)主要是由國(guó)外公司開(kāi)發(fā)的價(jià)值昂貴、操作復(fù)雜的大型裝備系統(tǒng)，其普適性受到較大的限制。因此，開(kāi)發(fā)操作簡(jiǎn)單、成本相對(duì)不高的高通量篩選系統(tǒng)是重要的發(fā)展方向，特別是近年來(lái)基于微流控芯片的檢測(cè)和篩選系統(tǒng)更是受到極大的關(guān)注。

微流控芯片系統(tǒng)(Microfluidics)或微流控芯片實(shí)驗(yàn)室，是將化學(xué)和生物等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)及細(xì)胞培養(yǎng)、分選和裂解等基本操作單元集成到幾個(gè)平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，由可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)。目前的微流控芯片系統(tǒng)主要包括連續(xù)微流體系統(tǒng)和液滴微流體系統(tǒng)?；谶B續(xù)微流體的微流控芯片系統(tǒng)研究較多，已經(jīng)成功應(yīng)用在蛋白和核酸的電泳分析上，并有商品化的分析儀。相對(duì)于連續(xù)微流體系統(tǒng)，基于液滴微流體的微流控芯片系統(tǒng)最大的優(yōu)勢(shì)在于可以形成獨(dú)立的單個(gè)微液滴反應(yīng)器，可以據(jù)此對(duì)分析樣品進(jìn)行單獨(dú)包埋并在相互分開(kāi)、互不干擾的微液滴小室中進(jìn)行檢測(cè)分析，使得檢測(cè)和篩選細(xì)胞或其胞外分泌產(chǎn)物成為可能。該系統(tǒng)具有速度快、通量高、成本低等顯著特點(diǎn)，對(duì)開(kāi)展定向進(jìn)化改造工程用酶，研究外分泌胞外產(chǎn)物(代謝產(chǎn)物)等相關(guān)研究領(lǐng)域具有重要的推動(dòng)作用。

由于微生物篩選實(shí)驗(yàn)通常需要較長(zhǎng)的時(shí)間，所以對(duì)微流控芯片中的微液滴有更高的要求，如提高微液滴的穩(wěn)定性，優(yōu)化生物兼容性以及防止微液滴內(nèi)水相物質(zhì)滲漏到油相等。本研究針對(duì)以上問(wèn)題，以代謝產(chǎn)物(氨基酸)為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)包埋氨基酸的皮升級(jí)微液滴特性的研究，為液滴微流控芯片系統(tǒng)在氨基酸檢測(cè)和相應(yīng)生產(chǎn)菌株的高通量篩選以及定向進(jìn)化改造方面奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

含有pET30a-mCherry的大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)菌株來(lái)由實(shí)驗(yàn)室保存，該菌株可以誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生熒光蛋白mCherry，用于檢測(cè)微液滴的生物活性兼容性。

1.1.2 儀器與芯片

532nm激光器購(gòu)自長(zhǎng)春新產(chǎn)業(yè)光電技術(shù)有限公司；聚焦物鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯公司；Nikon1J1高速攝像機(jī)購(gòu)自Nikon公司；532nm、610nm濾光片均購(gòu)自北京卓立漢光儀器有限公司；光電倍增管購(gòu)自CenturianSurplus公司；PCI6070e數(shù)據(jù)采集卡購(gòu)自NationalInstruments公司；MODEL609E-6高壓放大器購(gòu)自Trek公司；Mitos壓力泵購(gòu)自環(huán)球分析測(cè)試儀器有限公司；硅片購(gòu)自上海齊鳴硅材料有限公司；SU-8 2025光膠購(gòu)自美國(guó)MicroChem公司；等離子清洗機(jī)購(gòu)自美國(guó)Harrick公司；勻膠機(jī)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微電子研究所；加熱臺(tái)購(gòu)自誼華電子設(shè)備有限公司；紫外光刻機(jī)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院光電技術(shù)研究所；微流控芯片為自制PDMS芯片，PDMS購(gòu)自Momentive公司。

1.1.3 主要試劑

AbilEM90購(gòu)自EvonikDegussa公司；礦物油、鈣黃綠素、Span80、CuCl2、EDTANa2均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；各種氨基酸均購(gòu)自Solarbio公司；IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)、氨基酸氧化酶和過(guò)氧化氫酶均購(gòu)自Sigma公司；丙二醇甲醚醋酸酯購(gòu)自阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司；異丙醇購(gòu)自北京化工廠(chǎng)；熒光底物AmplexUltraRed購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 液滴微流控芯片整合控制系統(tǒng)的搭建(光路設(shè)置、數(shù)據(jù)采集和控制系統(tǒng))及工作流程

如圖1所示，本液滴微流控芯片整合控制系統(tǒng)采用非聚焦光路。

圖1液滴微流控芯片整合控制系統(tǒng)示意圖

激光器發(fā)出波長(zhǎng)為532nm，發(fā)射后的激光通過(guò)濾光片除去雜波，然后聚焦到微流控芯片的檢測(cè)點(diǎn)。當(dāng)包埋熒光物質(zhì)的微液滴通過(guò)檢測(cè)點(diǎn)時(shí)被激發(fā)產(chǎn)生熒光，熒光經(jīng)聚焦物鏡聚焦后到達(dá)分光鏡。通過(guò)分光鏡將一部分熒光傳給高速攝像機(jī)，實(shí)時(shí)監(jiān)控微液滴的流動(dòng)情況；另一部分熒光則通過(guò)濾光片，由光電倍增管(PMT)接收并將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電壓信號(hào)后，由數(shù)據(jù)采集卡采集并由LabVIEW軟件進(jìn)行分析。高壓放大器用于微液滴的偏轉(zhuǎn)，當(dāng)目標(biāo)微液滴的檢測(cè)信號(hào)超過(guò)分選設(shè)定閾值時(shí)，分析軟件通過(guò)高壓放大器和微流控芯片上的電極對(duì)微液滴施加偏轉(zhuǎn)電壓。由于介電電泳力的作用，目標(biāo)微液滴將發(fā)生偏轉(zhuǎn)，流至分選通道得到收集。

1.1.1 液滴微流控檢測(cè)分選芯片制備和微液滴生成

微流控芯片通過(guò)模塑法制備。首先根據(jù)要求利用AutoCAD軟件設(shè)計(jì)芯片圖形(圖2A)并獲得相應(yīng)的光刻掩模(掩模由深圳美精微光電股份有限公司制作)，然后通過(guò)光刻法將圖形轉(zhuǎn)移到芯片上。具體步驟是：首先選取潔凈的硅片，放到等離子機(jī)清洗4min，然后用勻膠機(jī)以1800r/min的轉(zhuǎn)速均勻的覆蓋一層50μm的SU-82025光膠，并在95℃下預(yù)烘30min；待其冷卻后在光刻掩模下紫外曝光20s，在95℃烘40min；將未曝光的光膠用丙二醇甲醚醋酸酯和丙三醇交替沖洗干凈，在110℃下加熱30min，即獲得所需芯片通道的陽(yáng)模。芯片由目前被廣泛采用的PDMS材料制作，PDMS具有較好的透氣性、良好的透光性和生物兼容性[15-16]。將PDMS預(yù)制劑和交聯(lián)劑以10：1的比例均勻混合后，倒在制備好的陽(yáng)模上，在60℃下加熱4h使其固化。揭下該含有微流通道的PDMS并與另一塊平整的PDMS封合，即得所需芯片，芯片實(shí)物如圖2B所示。微流控芯片以Mitos壓力泵作為流體動(dòng)力，利用PEEK材質(zhì)的塑料管將其與芯片連接，采用流動(dòng)聚焦(Flow-focusing)方式在芯片內(nèi)生成微液滴。

圖2微流控芯片設(shè)計(jì)示意圖(A)及實(shí)物圖(B)

1.2.3微液滴特性研究和氨基酸包埋檢測(cè)分析

利用微流控芯片生成油包水(w/o)的微液滴，通過(guò)包埋含有pET30a-mCherry的E.coli細(xì)胞并檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)熒光蛋白的表達(dá)量，測(cè)定由不同表面活性劑組成的微液滴對(duì)細(xì)胞活性的影響作用。根據(jù)微液滴的形態(tài)學(xué)檢測(cè)，對(duì)生成的微液滴的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。參照Kendall等研究方法[19-20]對(duì)微液滴的分子擴(kuò)散情況進(jìn)行研究。

氨基酸的熒光檢測(cè)采用雙酶偶聯(lián)法。以谷氨酸與熒光底物AmplexUltraRed反應(yīng)后的混合體系作為水相，以添加非離子型表面活性劑的礦物油為油相，生成包埋氨基酸反應(yīng)體系的皮升體積微液滴，并對(duì)微液滴進(jìn)行在線(xiàn)的熒光檢測(cè)和篩選。通過(guò)類(lèi)似方法對(duì)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也進(jìn)行了檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1微液滴的生成

如圖3所示，利用流動(dòng)聚焦(Flowfocusing)方式生成微液滴，通過(guò)改變油、水兩相的流速可獲得理想大小的微液滴。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自行設(shè)計(jì)的芯片生成的微液滴具有良好的單分散性(微液滴間相互獨(dú)立)和均一性，微液滴直徑可控制在20?50?m范圍內(nèi)，生成速度每分鐘600?1200個(gè)。

圖3微液滴的生成

2.2微液滴的生物活性兼容性

油包水(w/o)微液滴作為微反應(yīng)器用于細(xì)胞培育或者代謝產(chǎn)物的反應(yīng)，都要求微液滴有較好的生物兼容性，因而油相組分，尤其是表面活性劑的選擇非常重要[11]。相對(duì)于離子型表面活性劑，非離子型表面活性劑對(duì)細(xì)胞和蛋白不造成強(qiáng)靜電作用力的損害，因此，具有更好的生物活性兼容性。本研究對(duì)目前使用較多的w/o非離子型表面活性劑Span80和AbilEM90進(jìn)行了測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中以分別添加3%(V/V)Span80和3%(V/V)AbilEM90的礦物油作為油相，對(duì)添加IPTG的E.coliBL21(DE3)(含有pET30a-mCherry)細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行微液滴包埋，并對(duì)微液滴進(jìn)行37℃靜置培養(yǎng)。通過(guò)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)微液滴的熒光值(Ex/Em:490nm/585nm)來(lái)反映微液滴內(nèi)的細(xì)胞蛋白生物表達(dá)量。如圖4所示，添加表面活性劑AbilEM90的礦物油包埋的E.coli細(xì)胞具有更高的熒光蛋白表達(dá)量，表面活性劑AbilEM90比Span80有更好的生物兼容性(圖4)。故本實(shí)驗(yàn)最終選擇含3%(V/V)AbilEM90的礦物油作為油相。
2.3微液滴的穩(wěn)定性

微液滴需要在一定時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定存在，從而為其檢測(cè)篩選提供基礎(chǔ)。因此，穩(wěn)定性是微液滴的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)將谷氨酸等4種氨基酸分別進(jìn)行微液滴包埋，對(duì)生成的微液滴在離線(xiàn)條件下室溫培養(yǎng)，利用顯微照相系統(tǒng)觀察不同時(shí)間點(diǎn)微液滴的穩(wěn)定狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微液滴室溫培養(yǎng)20h后形態(tài)仍然保持穩(wěn)定(圖5)。對(duì)比培養(yǎng)前，98%的微液滴無(wú)融合和破裂，可以有效滿(mǎn)足細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)熒光信號(hào)檢測(cè)的要求。

圖4表面活性劑對(duì)微液滴內(nèi)細(xì)胞活性的影響

2.4微液滴的分子擴(kuò)散

在培養(yǎng)過(guò)程中，如果微液滴內(nèi)包埋的水相物質(zhì)擴(kuò)散到液滴外，并進(jìn)入到另外一個(gè)微液滴內(nèi)，必然影響檢測(cè)和分選的效率，所以微液滴間低分子擴(kuò)散與否非常重要。好的微液滴應(yīng)該是包埋物質(zhì)既沒(méi)有滲透到微液滴外，也沒(méi)有在液滴間發(fā)生交叉污染。擴(kuò)散性是微液滴作為互不干擾的獨(dú)立微反應(yīng)器的重要指標(biāo)。參照Kendall等人提出的方法對(duì)微液滴分子擴(kuò)散情況進(jìn)行了檢驗(yàn)。

采用含3%(V/V)AbilEM90的礦物油作為油相，5mmol/L鈣黃綠素、10mmol/LCuCl2、0.1mmol/L谷氨酸混合液作為水相1，乳化成的微液滴為E1；50mmol/LEDTANa2作為水相2，乳化成的微液滴為E2；水相1和水相2以體積比15混合作為水相3，乳化成的微液滴為E3；微液滴E1和微液滴E2以體積比15混合為微液滴ME，測(cè)定4種微液滴在不同時(shí)間點(diǎn)的熒光值(Ex/Em：490nm/515nm)。結(jié)果表明，室溫培養(yǎng)20h后，微液滴ME的熒光值幾乎沒(méi)有變化，微液滴間的分子交換＜2%，對(duì)微液滴的檢測(cè)和分選影響可以忽略(圖6)。因此，選擇含3%(V/V)AbilEM90的礦物油作為油相生成的微液滴內(nèi)物質(zhì)無(wú)明顯的分子擴(kuò)散，可作為微反應(yīng)體系。

圖5微液滴穩(wěn)定性

2.5氨基酸包埋微液滴的檢測(cè)與分選

在上述研究基礎(chǔ)上，利用搭建的液滴微流控芯片系統(tǒng)對(duì)氨基酸進(jìn)行了檢測(cè)與分選。實(shí)驗(yàn)以?xún)煞N濃度的谷氨酸(10?mol/L和20?mol/L)為檢測(cè)對(duì)象，通過(guò)液滴包埋，在圖2所示的芯片中生成含有兩種谷氨酸濃度的微液滴，生成速度為每分鐘600個(gè)。

圖6微液滴間的分子交換

兩種不同濃度氨基酸包埋微液滴的熒光檢測(cè)信號(hào)如圖7所示。其中，包埋20?mol/L谷氨酸的微液滴熒光值高于設(shè)定的閥值，軟件自動(dòng)給出信號(hào)到高壓放大器，產(chǎn)生偏轉(zhuǎn)電壓使微液滴受介電力作用偏轉(zhuǎn)至“SORT”孔道，微液滴被分選，而包埋10?mol/L谷氨酸的微液滴不會(huì)被分選，流向“WST”孔道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究設(shè)計(jì)的液滴微流控芯片系統(tǒng)具有氨基酸檢測(cè)與分選功能，檢測(cè)分選通量可達(dá)到每分鐘600個(gè)。

圖7谷氨酸微液滴的熒光檢測(cè)與分選

3總結(jié)

液滴微流控芯片的優(yōu)勢(shì)在于可以形成相互獨(dú)立無(wú)干擾的單個(gè)微液滴反應(yīng)器，如果將每一個(gè)微液滴看成一個(gè)微反應(yīng)器或者細(xì)胞培養(yǎng)器進(jìn)行高通量的檢測(cè)與分選，將為研究外分泌胞外產(chǎn)物(代謝產(chǎn)物)及其工程菌株的定向進(jìn)化提供強(qiáng)有力的篩選平臺(tái)。

本研究搭建的液滴微流控芯片高通量篩選平臺(tái)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作方便等特點(diǎn)。利用該平臺(tái)進(jìn)行了包埋氨基酸的微液滴的生成、微液滴特性研究和熒光檢測(cè)與分選實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：1)生成的微液滴直徑可控，大小均一、穩(wěn)定，微液滴內(nèi)反應(yīng)體系小，可節(jié)省大量試劑；2)微液滴可以長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在，滿(mǎn)足試劑反應(yīng)或細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)時(shí)間的要求；3)微液滴的包埋物在測(cè)試微液滴中穩(wěn)定存在，微液滴間無(wú)交叉污染，不會(huì)對(duì)后期微液滴的熒光檢測(cè)和分選產(chǎn)生影響；4)微液滴的篩選通量可達(dá)每分鐘600個(gè)。這些實(shí)驗(yàn)為酶及氨基酸等細(xì)胞分泌物的檢測(cè)分析和相應(yīng)生產(chǎn)菌株的篩選提供了高通量篩選的可能，對(duì)液滴微流控芯片在定向進(jìn)化方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

文獻(xiàn)鏈接：

DOI: 10.13345/j.cjb.130361

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