高密度脂蛋白(HDL)是一種由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成的，在形狀、密度、顆粒大小、電荷和理化特性等方面都具有較大異質(zhì)性的脂蛋白，它參與膽固醇逆運(yùn)轉(zhuǎn)，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)作用。HDL亞類成分可以作為評(píng)估AS的危險(xiǎn)因素，與冠心病(CHD)密切相關(guān)，但對(duì)于亞類HDL2和HDL3的相對(duì)重要性問(wèn)題在臨床上一直存在分歧，國(guó)際上仍未得到統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，其中一重要原因是因?yàn)槿狈?jiǎn)易、準(zhǔn)確的HDL亞類分析方法。

微流控芯片電泳能夠快速高效分離分析DNA、氨基酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞等，分離效率高、重復(fù)性好。本研究利用自制的石英芯片結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測(cè)系統(tǒng)，在本研究組前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步改良，可簡(jiǎn)便、高效分離出HDL亞類，并對(duì)健康體檢者和CHD患者血清標(biāo)本進(jìn)行分析，初步探討了微流控芯片電泳用于HDL亞類分析的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

南通大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)的CHD患者、排除心腦血管疾病及其他影響血脂代謝疾病的健康體檢者。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑。濃度為15.5g/L的HDL標(biāo)準(zhǔn)品、Tricine、甲基葡胺(MEG)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二醇、甲醇、磷鎢酸PTA)、氯化鎂(MgCl2)、溴化鉀(KBr)；硝基苯并噁二唑-C6-酰基鞘胺醇(NBDC6-ceramide)；沉淀劑按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)學(xué)分會(huì)推薦的PTA-Mg沉淀法中描述配制(1.52mmol/LPTA、0.05mol/LMgCl2，pH6.1)；樣品緩沖液由40mmol/LTricine、50mmol/LMEG、0.2mmol/LSDS(pH8.5)組成；分離緩沖液由40mmol/LTricine、50mmol/LMEG、0.01mmol/LSDS(pH8.5)組成。所用試劑均為分析純，配制試劑用水為二次蒸餾水，試劑配置好后均用0.22滋m的濾膜過(guò)濾。

1.2.2 儀器。LIF檢測(cè)系統(tǒng)(自行研制)；OptimaTML-90K型超速離心機(jī)；7600-020全自動(dòng)生化分析儀；CX系統(tǒng)電源(0～5000V)。

1.2.3 自制芯片。石英玻璃經(jīng)光刻、濕法腐蝕、高溫鍵合而成，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。整個(gè)芯片大小為64mm伊32mm,芯片微管道寬100滋m,深約25滋m,芯片樣品池到十字交叉點(diǎn)長(zhǎng)4mm，有效分離長(zhǎng)度為42mm，儲(chǔ)液池的直徑為2mm。樣品池1和樣品廢液池2間通道用于進(jìn)樣，緩沖液池3和緩沖液廢液池4間通道用于電泳分離。

Fig.1Structureforthemicrochip(a)Chip.(b)TheSEMphotographforthecross-pointchannel.1:Samplereservoir;2:Samplewasterreservoir;3:Bufferreservoir;4:Bufferwasterreservoir.

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本準(zhǔn)備。受試者素食3天后，清晨空腹采血3ml，以3000r/min離心10min后分離血清，所取血清標(biāo)本加入同體積沉淀劑，充分混勻，置室溫15min后3000r/min離心15min，離心后吸出上清液供測(cè)定。要求4h之內(nèi)完成分離檢測(cè)，或-70℃保存。HDL標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)處理過(guò)程：1滋lHDL標(biāo)準(zhǔn)品加入10滋l去離子水，再加入4滋l0.2g/LNBDC6-ceramide(以v(乙二醇)∶v(甲醇)=9∶1混合液預(yù)先溶解)避光預(yù)染1min，最后加入60滋l樣品緩沖液。血清標(biāo)本預(yù)處理過(guò)程：6滋l預(yù)測(cè)血清加入2滋l去離子水，再加入4滋l0.2g/LNBDC6-ceramide避光預(yù)染1min，最后加入20滋l樣品緩沖液。

1.3.2 電泳過(guò)程。在芯片樣品廢液池、緩沖液池、緩沖液廢液池中加入分離緩沖液，并使通道內(nèi)充滿分離緩沖液。在樣品池中加入樣品，使激光束聚焦于芯片分離通道下檢測(cè)點(diǎn)處。按下列程序分別向4個(gè)儲(chǔ)液池施加電壓，進(jìn)行進(jìn)樣和分離操作：進(jìn)樣45s，樣品池、樣品廢液池、緩沖液池、緩沖液廢液池分別施加760V、0V、300V和450V電壓；分離4min，樣品池、樣品廢液池、緩沖液池、緩沖液廢液池分別施加500V、500V、3500V和0V電壓。運(yùn)行溫度25℃，分離電場(chǎng)強(qiáng)度為450V/cm.

1.3.3 電泳原理。石英芯片微通道表面在緩沖液是堿性的情況下，硅羥基解離產(chǎn)生負(fù)電荷，緩沖液中陽(yáng)離子在芯片管壁負(fù)電荷表面形成一圓筒形的陽(yáng)離子鞘，在外加電場(chǎng)作用下，攜帶溶劑一齊向陰極遷移，便形成電滲流。管道中HDL亞類的遷移速度是外加電場(chǎng)、溶劑阻力與電滲流作用的結(jié)果，由于電滲流的作用通常大于帶電粒子所受電場(chǎng)力作用，所以樣品粒子在管道進(jìn)行與電滲流方向一致的差速遷移。最后通過(guò)末端檢測(cè)器的檢測(cè)并記錄得到電泳圖譜。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析。采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用x依s表達(dá)。組間差異比較使用方差分析，P<0.05有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1HDL亞類的峰型鑒定

HDL標(biāo)準(zhǔn)品的電泳圖譜見(jiàn)圖2，HDL被分為2個(gè)區(qū)帶(a，b區(qū)帶)，其出峰時(shí)間分別為1.5min和1.8min，4min內(nèi)完成分離。根據(jù)Havel等[10]報(bào)道的超速離心法制備HDL2和HDL3，HDL2加入到分析樣品中b區(qū)帶明顯增高、面積增大，見(jiàn)圖3；HDL3加入到分析樣品中a區(qū)帶明顯增寬、面積增大，見(jiàn)圖4。可以判定快速遷移峰a為HDL3，慢速遷移峰b為HDL2。

2.2沉淀劑處理前后血脂水平的測(cè)定

表1為隨機(jī)選取一健康體檢者血清標(biāo)本，生化分析儀測(cè)得的沉淀劑處理前后血脂水平。沉淀劑處理后血清被2倍稀釋，所以處理后測(cè)得指標(biāo)乘以2。

Fig.2EletropherogramoftheseparationofstandardHDLTheinjectionconcentrationofHDLwas80滋mol/L.Separationconditions:Samplebuffersolutioncontained0.2mmol/LSDS,40mmol/LTricine,50mmol/LMEGatpH8.5.Separationbuffersolutioncontained0.01mmol/LSDS,40mmol/LTricine,50mmol/LMEGatpH8.5,withEat450V/cm.

Fig.3EletropherogramofthemixturesofstandardHDLand2滋gHDL2SeparationconditionswerethesameasdescribedinFigure2.

Fig.4EletropherogramofthemixturesofstandardHDLand2滋gHDL3SeparationconditionswerethesameasdescribedinFigure2.

Table1Theserumlipidlevelsofhealthysubjectsbeforeandaftertheserumtreatedbyprecipitatingagent

2.3臨床血清HDL的分析

圖5、圖6分別為健康體檢者和CHD患者血清標(biāo)本連續(xù)3次電泳分離結(jié)果。全自動(dòng)生化分析儀測(cè)得HDL-C濃度分別為1.78mmol/L和0.56mmol/L.

Fig.5EletropherogramsofthehealthysubjectanditsreproducibilitySeparationconditionswerethesameasdescribedinFigure2.

Fig.6EletropherogramsofthepatientwithCHDanditsreproducibilitySeparationconditionswerethesameasdescribedinFigure2.

2.4CHD患者與健康體檢者HDL亞類的峰面積

表2為受試標(biāo)本HDL2、HDL3峰面積的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，可見(jiàn)CHD患者HDL2(P<0.001)峰面積顯著低于健康體檢者組，CHD患者HDL3(P<0.001)峰面積顯著高于健康體檢者組,提示CHD患者HDL2有減少趨勢(shì)，HDL3有增多趨勢(shì)。

Table2PeakareaofserumHDLsubclasses

3討論

微流控芯片電泳可方便實(shí)現(xiàn)小體積(nl)進(jìn)樣、分離等操作，還可在分離時(shí)施加常規(guī)毛細(xì)管電泳難以達(dá)到的高場(chǎng)強(qiáng)，能達(dá)到快速、高效分離。微流控芯片電泳用于血清脂蛋白的分離分析是由Weiller等于2002年首次報(bào)道的，本研究組前期也有過(guò)基于微流控芯片電泳技術(shù)，利用自制的微芯片結(jié)合LIF檢測(cè)系統(tǒng)3min內(nèi)分離血清HDL、低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白[6]的相關(guān)報(bào)道，重復(fù)性和穩(wěn)定性均較好。

HDL是由脂質(zhì)(磷脂和游離膽固醇位于顆粒表面，膽固醇酯和三酰甘油位于核心)和蛋白質(zhì)(載脂蛋白和多種少量其他蛋白質(zhì))組成的復(fù)雜大分子.HDL不同亞類可以根據(jù)其密度、顆粒大小、電荷及組成不同進(jìn)行分離，分析方法主要有超速離心法、梯度凝膠電泳法、質(zhì)子核磁共振光譜法、免疫親和層析法、雙向電泳-免疫印跡法等，但這些方法多半費(fèi)時(shí)耗力，技術(shù)要求高，無(wú)法在臨床上推廣應(yīng)用。

本研究主要以微流控芯片電泳技術(shù)為平臺(tái)，結(jié)合LIF檢測(cè)系統(tǒng)，構(gòu)建檢測(cè)血清HDL亞類的方法。研究中首先優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件。Tricine、MEG緩沖液具有較寬的pH范圍，在電泳過(guò)程中能夠保持穩(wěn)定的電滲流，使結(jié)果具有良好的重復(fù)性。MEG還具有動(dòng)態(tài)涂層作用，能部分消除管壁對(duì)蛋白質(zhì)的吸附。我們考察了MEG濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，最后發(fā)現(xiàn)MEG濃度為50mmol/L，Tricine濃度為40mmol/L時(shí)，HDL得到了最佳分離效果。脂蛋白顆粒在堿性溶液中帶負(fù)電荷，電泳過(guò)程中，荷質(zhì)比不同的脂蛋白組分在電滲流的驅(qū)動(dòng)下實(shí)現(xiàn)分離，在極端pH時(shí)有利于電滲流，但同時(shí)極端pH易使蛋白質(zhì)變性，影響檢測(cè)結(jié)果。我們對(duì)緩沖液pH進(jìn)行優(yōu)化，分別考察了pH值為7.8、8.0、8.2、8.5、8.8、9.2、9.8時(shí)HDL亞類的分離效果。最后發(fā)現(xiàn)，pH為8.5時(shí)，HDL分離效率最高。蛋白質(zhì)吸附會(huì)嚴(yán)重影響分離效率和重復(fù)性，SDS是一種陰離子型表面活性劑，Ceriotti等[12]通過(guò)激光散射分析實(shí)驗(yàn)證實(shí)，樣品溶液中存在低濃度的SDS時(shí)不會(huì)引起脂蛋白顆粒結(jié)構(gòu)的改變，我們分別在樣品緩沖液和分離緩沖液中添加了0.2mmol/L和0.01mmol/LSDS，有效提高了分離效率和分離度。

實(shí)驗(yàn)中使用的沉淀劑按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)學(xué)分會(huì)推薦的PTA-Mg沉淀法中描述配制，原理是利用沉淀劑中大分子多陰離子化合物(磷鎢酸鹽)與兩價(jià)陽(yáng)離子(鎂離子)沉淀血清中乳糜微粒、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和脂蛋白(a)，離心后上清液中只含有HDL一種脂蛋白。由表1可知，代表Table2PeakareaofserumHDLsubclassesCHD(n=18)Healthysubject(n=23)HDL20.285依0.039*0.552依0.096HDL31.394依0.091*1.108依0.074HDL3HDL2HDL3HDL2HDL3HDL20.30.60.91.21.51.82.12.42.73.03.33.63.9t/min0.0伊1000··221生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展Prog.Biochem.Biophys.2010;37(2)HDL的指標(biāo)HDL-C和載脂蛋白A1在沉淀劑處理前后幾乎不變，而代表低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和脂蛋白(a)的另3個(gè)指標(biāo)都近似0，由此斷定離心后上清液中只含有HDL一種脂蛋白。本實(shí)驗(yàn)中使用的熒光染料NBDC6-ceramide是一種能與脂蛋白顆粒特異性結(jié)合的染料，不受血清中其他物質(zhì)干擾。

圖5、圖6分別為健康體檢者和CHD患者血清HDL連續(xù)3次進(jìn)樣電泳圖譜，HDL3和HDL2峰均得到基線分離，且重現(xiàn)性良好，圖5、圖6中HDL2峰的出峰時(shí)間和峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.76%、2.92%和2.85%、2.93%，HDL3峰的出峰時(shí)間和峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.15%、2.24%和2.17%、2.31%。表2為18例CHD患者血清標(biāo)本和23例健康體檢者血清標(biāo)本的HDL亞類峰面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果。可見(jiàn)，CHD患者HDL2顯著降低(P<0.01)，HDL3顯著升高(P<0.01)，可能是因?yàn)镃HD患者逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的能力降低，新生的HDL3較難轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腍DL。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們將進(jìn)一步優(yōu)化方法學(xué)，并選擇合適的內(nèi)標(biāo)，爭(zhēng)取快速簡(jiǎn)便完成定量測(cè)定。

綜上所述，本研究以微流控芯片電泳技術(shù)為平臺(tái)，結(jié)合LIF檢測(cè)系統(tǒng)，HDL亞類在4min內(nèi)達(dá)到高效分離，重復(fù)性較佳，測(cè)試費(fèi)用低廉，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)、繁瑣等不足，具有較大的推廣價(jià)值。

文獻(xiàn)來(lái)源生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展DOI:10.3724/SP.J.1206.2009.00506作者：鄭慧斐叢輝王惠民（轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）