0  引言

目前，食品安全問題在全球越來越受到重視。無論是對頻發(fā)中毒現(xiàn)象的食品以及召回事件的食物品質(zhì)的改善，還是人們對營養(yǎng)健康日益增加的需求，都需要科學(xué)技術(shù)的不斷創(chuàng)新和大力支持。這就促使各種食品高新檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，從20世紀(jì)80年代的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）到后來的熒光定量PCR反應(yīng)，各種新的分子生物技術(shù)開始逐步應(yīng)用到食品檢測中。

20世紀(jì)90年代，生物芯片作為一種全新的生物技術(shù)逐漸成熟并發(fā)展壯大起來。該技術(shù)具有高通量、微量化和自動化等特點。伴隨著芯片技術(shù)的迅猛發(fā)展，生物芯片在醫(yī)療領(lǐng)域]、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域以及國防領(lǐng)域都有所突破，作者簡要介紹生物芯片的基本原理，并對生物芯片在食品安全、營養(yǎng)與品質(zhì)檢測方面的應(yīng)用作了較為詳細(xì)的介紹。

1  生物芯片概述

生物芯片技術(shù)是一項綜合的高新技術(shù)，涵蓋了生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理學(xué)、材料學(xué)、電子技術(shù)、生物信息學(xué)、機(jī)密儀器等交叉研究領(lǐng)域。生物芯片（biochip）是指將標(biāo)記的生物探針固定排列于支持物（硅片、載玻片或高分子聚合物薄片）上，待檢測樣品與支持物上的探針發(fā)生特異性親和反應(yīng)后，通過掃描并借助計算機(jī)軟件分析每一探針上的標(biāo)記信號，從而完成對DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)的檢測。它包含三大領(lǐng)域：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和芯片微縮實驗室。基因芯片是利用樣品和探針之間基因的堿基配對原理進(jìn)行雜交。蛋白質(zhì)芯片利用抗體和抗原之間特異性免疫的原理。芯片微縮實驗室則是集各種生物芯片于一體的生物分析系統(tǒng)，使用方便快捷且高效便攜，是未來生物芯片的發(fā)展方向。相比蛋白質(zhì)芯片和芯片微縮實驗室，基因芯片的應(yīng)用范圍和普及程度更為廣泛。生物芯片是微量生化分析的基礎(chǔ)，相比傳統(tǒng)的分析方法，它的優(yōu)勢顯著：各種分析物可以在同一樣品上同時進(jìn)行研究；所需樣本量少；對于稀缺試劑的消耗量低；高度微量化；高通量。它可廣泛應(yīng)用于疾病診斷和治療、藥物篩選、農(nóng)作物的優(yōu)育優(yōu)選、食品檢測、環(huán)境檢測、國防等領(lǐng)域?？傊?，凡與生命活動有關(guān)的領(lǐng)域中，生物芯片均有其重大的應(yīng)用前景。

制備生物芯片所需的載體材料必須是固體片狀或者膜，由于玻璃方便易得且熒光背景低，故玻璃片是最為常用的載體材料，通常會將活性基因連接在載體玻片上。以基因芯片為例，其制作技術(shù)主要有3步：芯片制備、樣品制備與雜交、芯片的檢測與分析。其中芯片制備包括原位合成和預(yù)合成后點樣。

2  生物芯片在食品安全檢測中的應(yīng)用

中國食品行業(yè)安全問題日益突顯，傳統(tǒng)的檢測方式對于五花八門的造假摻假等問題顯得有些滯后，很多方法針對性弱，不能檢測出多種物質(zhì)或者耗時很長，不能用于現(xiàn)場的快速檢測。所以生物芯片的開發(fā)就顯得很有必要，既有利于企業(yè)的驗收把關(guān)，也有利于監(jiān)管部門的嚴(yán)格監(jiān)管，保護(hù)消費者的利益。

2.1  食源性病原微生物的檢測

很多食品營養(yǎng)豐富，是微生物的良好培養(yǎng)基，從農(nóng)田到餐桌的每一個過程中都可能引起微生物對食品的污染。傳統(tǒng)微生物檢測主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)。但ELISA法重復(fù)性不好、受自身抗體干擾容易出現(xiàn)假陽性。PCR難以滿足對多病毒的檢測，易污染及易出現(xiàn)假陽性。生物芯片的高通量、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點是傳統(tǒng)檢測方法不可比擬的。Huang提出了陳列式CMOS（Complementary Metal Oxide Semiconductor）生物電信號傳感芯片和聚合酶生物芯片的光學(xué)酶檢測系統(tǒng)對致病性大腸桿菌進(jìn)行檢測。在這種測定方法中，使用4-甲基傘形酮-beta-D-葡糖苷酸作為熒光底物，可檢出0.1U/mL的beta-醛酸苷酶，大約相當(dāng)于106CFU/mL的大腸桿菌細(xì)胞。該光學(xué)酶檢測系統(tǒng)靈敏且快速。Tachibana等發(fā)明了可以定量檢測病原微生物的一次性自動微流控PCR塑料芯片。為了實現(xiàn)通用性，他采用了環(huán)烯烴聚合物作為芯片的基片。該PCR芯片的人體、大腸桿菌、致病大腸桿菌O157的DNA最低檢測限度分別為4、0.0019、0.031pg/μL，且均在18min內(nèi)檢出。該研究提供了一種快速、易操作、低成本的PCR檢測方法。Manzano等設(shè)計了基于深藍(lán)色有機(jī)發(fā)光二極管的小型高敏感DNA芯片。為了激發(fā)熒光共軛的DNA探針對二極管的分子設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化，為獲得較高的靈敏度和特異性使用真正的肉類樣本進(jìn)行測試。最后用經(jīng)典平板方法和分子生物學(xué)方法來驗證DNA芯片所取得的結(jié)果。該有機(jī)發(fā)光二極管芯片的最低檢測限度為0.37ng/μL，在24h內(nèi)可得到所需結(jié)果。

Koo等通過研究得出微流控芯片能精確檢測病原微生物的先決條件是：能在生物傳感器上高效捕獲目標(biāo)物。他們用被生物素標(biāo)記的熱休克蛋白作為捕獲分子，在微流控環(huán)境中檢測出了單核細(xì)胞增生李斯特菌。并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)在孵化時施加5min的介電電泳力，可使熱休克蛋白的捕獲率增加60%。Eom等選取了7種食源性病原體，用他們發(fā)明的基于寡核苷酸的芯片檢測系統(tǒng)對病原體各自的16SrDNA特定序列進(jìn)行評估。并用開發(fā)的一個二維可視化工具對結(jié)果做了驗證，證明該系統(tǒng)可用于多種病原體的檢測。Ikeda等開發(fā)了快速微珠法檢測致病細(xì)菌的微流控芯片系統(tǒng)。他們選取4種細(xì)菌（大腸桿菌、沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和蠟狀芽孢桿菌）作為食源性致病菌的代表菌種。該系統(tǒng)將5個寡核苷酸探針對應(yīng)的目標(biāo)細(xì)菌的16SrRNA與熒光微珠結(jié)合，熒光標(biāo)記從4種細(xì)菌中提取的RNA，并與固定化寡核苷酸探針熒光微珠雜交。用微流控芯片系統(tǒng)分析復(fù)式RNA及微珠，3h后可以得出結(jié)果。

2.2  生物毒素的檢測

在正常情況下，人體有能力化解和排除部分微量的毒素以維持自身健康。一旦平衡被打破，體內(nèi)毒素得不到及時清除而不斷累積，人體則會進(jìn)入亞健康狀態(tài)，進(jìn)而引發(fā)多種疾病。生物毒素的檢測也是不可或缺的。

Pennacchio等通過表面等離子體共振生物芯片來檢測棒曲霉素毒素。棒曲霉素是青霉和黑曲霉屬真菌有毒的次生代謝產(chǎn)物，能引起胃潰瘍和腸道炎癥，常存在于感冒藥中。傳統(tǒng)的檢測方式需要昂貴的分析儀器，該項研究提出了新的競爭免疫測定方法來檢測感冒藥。試驗中很重要的檢測方式是表面等離子體共振光學(xué)技術(shù)。激光誘導(dǎo)生物芯片表面金屬附近的探針和目標(biāo)分子相互作用，很容易測出輕微改變的反射率，從而檢測棒曲霉素毒素。Rubina等用水凝膠生物芯片同時檢測出了7種金黃色葡萄球菌腸毒素（A、B、C1、D、E、G和I）。該方法先表達(dá)純化重組毒素，產(chǎn)生抗毒素的單克隆抗體。設(shè)計制造出可以篩選單克隆抗體及最優(yōu)毒素抗體的生物芯片。最后再設(shè)計可以定量分析毒素的診斷生物芯片。若在芯片表面涂金屬涂層可縮短2h的檢測時間。

Pandey等用釀酒酵母全細(xì)胞型電容式生物芯片檢測不同形式碳納米管的毒性。該芯片置于不同濃度的單壁、多壁和雙壁碳納米管中，在交流頻率下測定動態(tài)細(xì)胞表面電荷分布相對電容的變化。該芯片與碳納米管吸附力有很大關(guān)系。發(fā)達(dá)國家生產(chǎn)的該芯片可用于食品和環(huán)境樣品的高通量篩選。Ahn等構(gòu)造了基因毒性細(xì)胞陣列芯片進(jìn)行遺傳毒性試驗，8個重組發(fā)光細(xì)菌被成功地用來制作基因毒性細(xì)胞陣列芯片，用4個有明顯化學(xué)損傷的DNA來驗證該芯片的功能。根據(jù)遺傳毒性作用的具體過程，每個芯片的菌株都有明顯反應(yīng)。該芯片可以用來研究食品、藥物或環(huán)境中未知物質(zhì)的遺傳毒性機(jī)制。Jimena等用自動化微列陣芯片提取生咖啡中的赭曲霉素A，并用化學(xué)發(fā)光檢測法檢測由可再生免疫生物芯片篩選出的赭曲霉素A。他們通過接觸式點樣，合成了一種共價固定在玻璃芯片上的與水溶性肽共軛羧基化的赭曲霉素A。該芯片可用間接競爭免疫來測定赭曲霉素A。

2.3  殘留農(nóng)獸藥的檢測

不管何種食品中殘留有抗生素，均會嚴(yán)重影響食品的品質(zhì)。食用抗生素使得人體內(nèi)有益菌被抑制、致病菌產(chǎn)生耐藥性。“無抗奶”是一個通用的國際化原料奶的收購標(biāo)準(zhǔn)，其他食品中也有對抗生素限制的標(biāo)準(zhǔn)。

Gaudin等根據(jù)歐洲指南中檢測獸藥殘留方法，用生物芯片技術(shù)檢驗了6種蜂蜜中的抗生素。蜂蜜沒有任何抗生素最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，Gaudin參考了2007年出版的歐盟標(biāo)準(zhǔn)實驗室的控制方法和分析性能中關(guān)于蜂蜜中的抗生素殘留控制的策略，用競爭化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測抗菌藥物。特異性優(yōu)良，且適用于不同種類的蜂蜜。同樣是對蜂蜜中抗生素的檢測，Mahony等用化學(xué)發(fā)光的生物芯片陣列傳感技術(shù)檢測蜂蜜中硝基呋喃類抗生素的殘留。使用多路復(fù)用的方法，能同時檢測4個主要的硝基呋喃類抗生素代謝物。最后用高效液相色譜二級質(zhì)譜對測定結(jié)果進(jìn)行驗證。這個生物傳感器法具有發(fā)展?jié)摿?，適合作為一個在食品安全方面的目的篩選技術(shù)。

Kloth等設(shè)計了間接競爭化學(xué)發(fā)光免疫芯片法，僅需要幾分鐘就可同時檢測牛奶中13種抗生素的含量。他們對片基采取了多步化學(xué)處理后，最終在玻片表面修飾上環(huán)氧樹脂活化的PEG層，然后加入磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類等的衍生物，直接與環(huán)氧樹脂進(jìn)行共價結(jié)合。該方法靈敏度較高，且可重復(fù)使用50次，增加了測定的穩(wěn)定性和便捷性，且減少重新制備片基的成本。

作者：苗小草，陳萬義，張娟，游春蘋

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