5.暗場顯微鏡SEC（DFM SEC）

5.1. DFM-SEC中的局域表面等離子體共振（LSPR）

如今，金納米顆粒、銀納米顆粒和鍺納米顆粒等金屬納米顆粒已成為一類具有獨特光學、催化、機械和生物性能的材料。由于其卓越的抗菌和抗炎作用，銀納米粒子已被廣泛應用于客戶產品（如手機、冰箱等）和醫(yī)學。金納米顆粒已被用于檢測細菌、太陽能電池和離子電解質。NP的局域表面等離子體共振（LSPR）的代表性照明如圖7a所示。導帶中的受限電子，即電子云，被入射電場（光）取代。由于剩余的固定和帶正電的原子核的庫侖力，帶負電的電子云再次被撤回。

富含電子的金屬NP，如AuNP、AgNP和PtNP，可以表現(xiàn)出固有的LSPR，這是由顆粒周圍局部環(huán)境的粒徑、形狀、成分、顆粒間間距和介電性能定義的（圖7b）。因此，NP在水懸浮液中的氧化/還原將導致LSPR頻率的變化?；谶@一特性，可以通過探測光譜消光光譜的變化來追蹤和分析NP的化學狀態(tài)。然而，這些信息無法通過既定的非光譜分辨光學方法訪問，這些方法只監(jiān)測信號強度。此外，很好地證明了NP的氧化還原電位與尺寸有關。NP的合成方案通常會導致NP尺寸分布的固有異質性。因此，可以在異質NP分布中觀察單個NP的研究將使研究人員能夠觀察到通過現(xiàn)有的集成電化學技術無法觀察到的趨勢。

5.2. DFM-SEC的應用

暗場散射技術正受到越來越多的關注，因為現(xiàn)有的原位測量（如熒光光譜和SERS）無法輕易揭示單個實體/納米級水平的變化。暗場顯微鏡（DFM）與電化學技術（以下簡稱DFM SEC）相結合，可以直接觀察單個NP上發(fā)生的化學反應。在圖7c中，光被載玻片上的NP散射。因此，載玻片上的NP在黑暗的背景下被明亮地照亮。然后，通過近紅外區(qū)域的散射來跟蹤LSPR。NP的LSPR消光最大值可以用DFM測量，并使用電子倍增電荷耦合器件（EMCCD）相機記錄。因此，DFM-SEC被應用于研究單個NP上的氧化過程。

當Au、Ag和Pt等納米結構富電子金屬的表面電子在表面等離子體共振條件下被光學激發(fā)時，它們表現(xiàn)出強烈的光散射和吸收特性。由于其優(yōu)異且穩(wěn)定的催化效率，金納米粒子已被廣泛應用于清潔能源轉換[80]。在這篇論文中，如圖8（a1，a2）所示，潘的團隊使用肼作為模型，在單個AuNP水平上研究了局部催化活性和結構-功能關系。在平面和小型化ITO電極上，使用光散射SEC方法實時分析了肼在AuNP上的電催化氧化動力學。與基于自發(fā)碰撞事件的NP檢測方法相比，ITO超微電極技術和DFS更好地理解了催化反應及其可重復性。

最近，Kevin等人使用DFM-SEC研究了在Cl-離子存在下單個AgNP（~50 nm）的實時原位氧化。圖8（b1）是Kevin等人的DFM-SEC裝置示意圖。使用高光譜成像（HSI）和CCD相機記錄CV（50 mV/s）電化學過程中光譜位置和LSPR強度的變化。圖8（b2）給出了CV期間不同施加電勢下單個AgNP的CCD快照。這使研究人員能夠觀察和分析AgNP在Cl-存在下的氧化還原過程。在施加約0.1V的電勢后，AgNP被氧化為氯化銀（AgCl）。隨著電勢的增加（~1V），AgCl繼續(xù)氧化為Ag2O3或AgClO2。在反向掃描過程中（電勢降至~0V），氧化物被還原為AgNP。值得注意的是，這項工作還提供了一種全面的微粒表征方法。

除了不同的NP外，DFM-SEC技術還使用了不同的納米結構金屬。出色的LSPR特性和高各向異性使Au三角形納米板（AuTNP）因其尖銳的頂點而脫穎而出，提供了電場增強的熱點。Gu等人最近的一項實驗工作表明，AuTNPs成功地用于靈敏和選擇性地監(jiān)測焦磷酸鹽（PPi）。這種關鍵的生物陰離子在各種基本生理過程（如細胞代謝和RNA和DNA聚合）中起著重要作用。這項工作是基于PPi對Cu2+和I-離子溶液中AuNPLs蝕刻的抑制作用。Cu2+和I-離子對AuNPL的蝕刻導致AuNPL LSPR散射光譜的藍移和強度降低。然而，由于PPi對Cu2+離子具有很強的親和力，添加PPi可以抑制AuNPLs的蝕刻。基于這些事實，顧等人成功建立了一個簡單、靈敏、選擇性的單顆粒分析平臺，用于定量檢測PPi，甚至用于真實的生物樣本。

6.SEC技術在微流體中的應用

眾所周知，微流體經常被引用的優(yōu)點，包括更快的響應時間、更低的試劑體積和集成潛力，是研究工作中的重要考慮因素。在研究了SEC技術的最新發(fā)展后，一個有趣的事實是，SEC和微流體的結合正成為研究論文的一種趨勢。然而，由于DFM技術的使用有限和NMR的受限細胞結構，目前的應用主要依賴于SERS/Raman或UV-Vis基SEC+微流體的組合。

6.1. SERS/Raman SEC在微流體中的應用

基于有限的可用論文，圖9顯示了使用集成技術進行的一些代表性研究。Singh等人提出了一種相對簡單但有吸引力的配置，用于高靈敏度檢測岡田酸（OA）。在這個組合檢測模塊中，微流控芯片被用來很好地混合OA和OA適配體。隨后對與OA適配體具有親和力的磷烯-金納米復合材料修飾的絲網印刷碳電極（SPCE）進行了分析。OA檢測的高性能，無論是定性還是定量，都表明所提出的護理點設備可以用于在捕魚單位進行農場檢測。

“固定”SERS活性基底是指具有特定形態(tài)的納米結構（如NP、納米柱森林和納米點陣列等）永久附著在基底上。例如，在Triroj等人最近發(fā)表的研究中，制備了類金剛石碳薄膜作為微流體裝置中的生物傳感平臺/基底，如圖9a所示。袁等人報道了一種原位微流體分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用納米結構的金表面作為WE，同時使用SERS活性基底。關于微流體裝置和納米結構Au基板的信息可以在圖9b中找到。然而，“Immobile”SERS基質的一個缺點是它們僅供一次性使用。隨著對重復“固定”SERS的追求，Belder等人通過施加脈沖電壓成功實現(xiàn)了SERS底物的再生，這已被證明具有很高的可重復性。這項工作將化學粗糙化的銀線結合到微流控芯片中，并用于SERS測量?；谒岢龅慕Y構，通過施加電勢來清潔SERS基板，實現(xiàn)了銀線SERS基板的電再生過程（圖9b）。此外，孔雀石綠拉曼光譜的高再現(xiàn)性證實了同一SERS底物的多次回收。

6.2. UV-Vis-SEC在微流體中的應用

同樣，UV-Vis SEC和微流體的組合方法已被廣泛應用于生物技術、催化、環(huán)境保護等領域。然而，與SERS/Raman SEC相比，UV-Vis SEC在微流體中的應用更多，這可能是因為電極基板更容易制備。如圖10（a1-a3）所示，在Colina等人報告的這項有趣的工作中，報告了一種使用或將商業(yè)SWCNT轉移到不同的非導體和透明載體上的簡單方法，如WE[174]。這項工作消除了WE制備過程中經常使用的液壓步驟，顯著擴大了將SWCNT薄膜轉移到幾乎任何載體上的可能性。這項工作的另一個有趣之處是使用了二維SEC技術。如圖10（a3）所示，兩種不同的光束布置，即正常和平行傳輸布置，被集成到同一設備中，以在二茂鐵甲醇電極過程中收集互補信息。Wang等人提出了另一種用于UV-Vis SEC的有趣微流體裝置。本文采用并行傳輸布置，避免了OTE。光譜測量是使用“內部”構建的可見微光譜儀進行的，該光譜儀由氘/鹵鎢光源和CCD光譜儀組成。

在圖10b所示的工作中，Seong等人首次報道了一種具有納米酶的電化學護理點裝置，用于高定量過氧化氫（H2O2），這是一種在細胞內發(fā)出信號的分子。電極（WE、CE、RE）是使用市場上可用的ITO電極制備的。然后，如圖10b所示，將人工納米結構酶固定在微流體通道中，在H2O2存在下對3,3′，5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物顯示出強大的催化活性。隨后使用UV-Vis-SEC技術分析藍色氧化TMB。最后，基于所提出的器件結構，成功實現(xiàn)了1μM至3 mM范圍內H2O2的廣泛檢測和1.62μM的低檢出限。

7.總結與展望

我們詳細介紹了復合SEC技術的最新發(fā)展，包括UV-Vis SEC、拉曼SEC、DFM SEC、NMR SEC，以及SEC技術和微流體相結合的最新進展。此外，還對工作原理和所選應用中遇到的問題進行了詳細分析。如上所述，電化學和光譜學（SEC技術）的結合已被應用于不同的研究領域，從電子轉移過程、反應機理、法醫(yī)學到電化學反應中中間體和最終產物的測定。此外，納米技術的不斷進步和新材料（NP、導電聚合物和復合材料）的使用進一步促進了SEC技術的發(fā)展。然而，上述每種SEC技術仍然存在一些局限性，從實驗室規(guī)模到廣泛的實際應用，總結如下：

UV-Vis-SEC——對于UV-Vis-SCE技術，如圖2所示，OTE幾乎是正常傳輸布置中不可避免的主題。（i） 然而，ITO和FTO等常用的OTE存在負惰性電位窗口較少的問題，薄膜金屬OTE由于相應的金屬氧化而僅限于需要高電位的電化學研究。因此，考慮到OTE的局限性，越來越多的人選擇平行排列配置，如表2所示。與正常的傳輸布置相比，并行布置配置更有利于進行二維SEC技術。（ii）然而，在并行工作模式下，需要光束的完美但困難的對準，使操作過程復雜化。

SERS SEC——根據(jù)科學網網站的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)，與其他SEC技術相比，拉曼SEC技術是使用最廣泛的一種（圖1b）?？紤]到拉曼信號的巨大增強因子，SERS和電化學之間的組合越來越多地被使用。已經制備并研究了不同的金屬/復合NP或其他受限的納米結構形態(tài)，如納米柱林和納米點陣列。然而，（i）對納米結構SERS活性基底的需求無疑會增加實驗的難度、成本和時間。（ii）考慮到納米顆粒合成的固有批次差異和儲存難度，一個重要問題是它們的可重復性。其他困難包括（iii）拉曼信號中的背景噪聲和（iv）用于納入護理點或使用點系統(tǒng)的復雜儀器。盡管存在手持式拉曼光譜儀，但它們受到分辨率和帶寬的限制。因此，開發(fā)拉曼活性SERS基底將是該SERS SEC技術廣泛應用的關鍵研究領域。

NMR SEC——對于NMR SEC技術，這似乎是最通用的輔助技術，用于識別捕獲的化學部分或小生物分子的分子特征。然而，由于核磁共振技術的低靈敏度問題，核磁共振SEC的大部分用途都集中在電化學過程中收集反應中間體的信息，以確定可能的反應途徑[77,78107]。NMR SEC廣泛使用的局限性是：（i）由于金屬導電電極導致的磁場均勻性惡化；以及（ii）使用薄金屬或非金屬電極，如碳微纖維或聚合物電極，通常需要復雜的制造協(xié)議。此外，由于可實現(xiàn)的電流低，非金屬電極通常具有有限的電化學應用。

DFM-SEC——與其他SEC技術不同，DFM-SEC技術更側重于從單一NP水平研究結構特征和催化劑活性之間的關系。由于納米級的理解對于設計和生產穩(wěn)定高性能的催化劑至關重要，然而，通過研究近年來發(fā)表的文章（圖1b），我們可以看到，在研究界廣泛應用之前，這項技術還有相當大的差距需要跨越。原因如下：（i）該技術對電極材料有很高的要求：DFM SEC中需要OTE。（ii）光路和電路的復雜耦合過程。（iii）此外，DFM SEC設置需要大量的光學元件，可能不容易整合到護理點或使用點系統(tǒng)中。（iv）DFM SEC的可靠性和設備間差異也是值得關注的問題。

總之，我們詳細介紹了復合SEC技術的最新發(fā)展，包括UV-Vis SEC、SERS SEC、NMR SEC和DFM SEC。詳細分析了它們在應用中遇到的工作原理挑戰(zhàn)和最新發(fā)展方向。使用SEC技術和微流體正在成為生物技術、催化、環(huán)境保護等研究領域的一個有趣趨勢。值得注意的是，從總結（表2）中可以看出，一些文章在研究中采用了原位二維SEC方法，這將更全面地了解試劑的反應機理、電子轉移機理、中間體、產物濃度和相關反應途徑。盡管存在許多兼容性問題、相互干擾、光路布局等，但這將是未來有前景的發(fā)展方向之一。盡管這些SEC技術有許多局限性需要突破，但隨著新功能材料和納米技術的不斷發(fā)展，人們最終將解決SEC技術中存在的這些問題（如UV-Vis/DFM SEC中的OTE、SERS SEC中SERS活性底物的可重復使用性，或NMR SEC中磁場的不均勻性）。這篇綜述文章將使更多的人，無論是成熟的研究人員還是新手，熟悉SEC技術的使用，并最終實現(xiàn)推廣SEC技術的目標。

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