微生物培養(yǎng)是微生物科學(xué)研究和工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域的重要基礎(chǔ)，廣泛應(yīng)用于微生物的分離、鑒定、分析、篩選、馴化、適應(yīng)性進(jìn)化、菌株改造等方面。然而，傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法主要以試管、搖瓶、固體平板為培養(yǎng)容器，輔以搖床、分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀等設(shè)備進(jìn)行微生物的培養(yǎng)、檢測(cè)和篩選，存在操作繁瑣、效率低、耗時(shí)、耗力、耗物等問(wèn)題。近年發(fā)展起來(lái)的高通量培養(yǎng)手段主要是以微孔板為容器建立起來(lái)的培養(yǎng)篩選體系，但微孔板一方面溶氧水平低，混合效果差、蒸發(fā)效應(yīng)和熱效應(yīng)比較嚴(yán)重，常常導(dǎo)致菌種生長(zhǎng)狀況差，且差異性大；另一方面需要配套昂貴的設(shè)備，如移液工作站、酶標(biāo)儀等，才能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化培養(yǎng)和過(guò)程檢測(cè)。

液滴微流控作為微流控技術(shù)的重要分支，是近年來(lái)在傳統(tǒng)連續(xù)流微流控系統(tǒng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，利用互不相溶的兩液相產(chǎn)生分散的微液滴并對(duì)微液滴進(jìn)行操作的非連續(xù)流微流控技術(shù)[7]。微液滴具有體積小、比表面積大，獨(dú)立無(wú)交叉污染等特點(diǎn)，再結(jié)合液滴可控性強(qiáng)、通量高等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)有研究將其用于微生物的高通量培養(yǎng)、馴化、篩選等方面，展現(xiàn)出重要的應(yīng)用潛力。然而，液滴微流控從實(shí)驗(yàn)室技術(shù)走向應(yīng)用推廣仍然存在一系列關(guān)鍵問(wèn)題。首先，液滴微流控操作繁瑣精細(xì)，技術(shù)要求和門(mén)檻高；其次，液滴微流控技術(shù)涉及光、機(jī)、電的元部件聯(lián)合使用，且需要和生物技術(shù)應(yīng)用場(chǎng)景結(jié)合，如果沒(méi)有多學(xué)科交叉協(xié)作，一般單個(gè)實(shí)驗(yàn)室或團(tuán)隊(duì)難以搭建高效的液滴微流控系統(tǒng)，從而無(wú)法開(kāi)展液滴在微生物技術(shù)中的廣泛應(yīng)用研究；再次，由于液滴體積極小(皮升–微升)，面向微生物傳代、進(jìn)化和分選的等基本操作的自動(dòng)化液滴精確操控與實(shí)時(shí)在線(xiàn)檢測(cè)實(shí)現(xiàn)難度大，難以形成一體化裝備系統(tǒng)。

液滴發(fā)生

基于微流控芯片的液滴發(fā)生技術(shù)常見(jiàn)的有3種，分別為流動(dòng)聚焦法、十字通道法、T形通道法，并且常常通過(guò)調(diào)節(jié)油相和水相的進(jìn)樣流速來(lái)控制生成液滴的大小。但由于芯片加工通常存在批次間誤差以及水相粘度差異等問(wèn)題，不同芯片往往需要調(diào)整油相和水相的流速參數(shù)，才能形成穩(wěn)定的微液滴，這些問(wèn)題一直是微流控芯片應(yīng)用于微生物培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)挑戰(zhàn)。如何低成本地設(shè)計(jì)能夠兼容芯片批次間誤差和樣品粘度差異等實(shí)際情況，且可以高精度地對(duì)液滴進(jìn)行操作的芯片系統(tǒng)成為關(guān)鍵?？紤]到T形通道結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單易加工、成本較低，本研究將該結(jié)構(gòu)引入芯片設(shè)計(jì)中。為了克服芯片批次誤差和樣品粘度差異等問(wèn)題，采用獨(dú)特的油相和水相間歇順次驅(qū)動(dòng)進(jìn)樣方法，進(jìn)而在芯片中生成體積大小精確可控的微液滴(圖 4A)，并通過(guò)巧妙串聯(lián)使用T形結(jié)構(gòu)通道，可以生成濃度梯度不同且精確可控的微液滴(圖 4B)。

圖 4 液滴操作系統(tǒng)：(A：液滴發(fā)生；B：多濃度梯度液滴發(fā)生；C：液滴分割融合；D：液滴分選)

液滴培養(yǎng)

微生物培養(yǎng)過(guò)程通常需要提供合適的溫度、氧氣等條件?；谖⒘骺氐暮醚跷⑸锱囵B(yǎng)，常常用透氣性良好的PDMS作為芯片材質(zhì)，輔以環(huán)境溫度控制，來(lái)滿(mǎn)足微生物的生長(zhǎng)需求。但是PDMS具有柔性較大、易形變等特點(diǎn)，給液滴的精確穩(wěn)定操作帶來(lái)了極大的負(fù)面影響，所以不適合用于本研究。因此，如何既能夠?qū)崿F(xiàn)液滴培養(yǎng)的氣體交換，又具備良好剛性和光學(xué)性能的芯片系統(tǒng)成為微生物微液滴培養(yǎng)的關(guān)鍵。而從目前已開(kāi)發(fā)的芯片材質(zhì)分析，透氣性和剛性往往不可兼得。為此，本研究提出了將液滴操作和液滴培養(yǎng)兩個(gè)過(guò)程分離的思路，即利用剛性強(qiáng)、光學(xué)性能優(yōu)的材料加工微流控芯片，利用透氣性強(qiáng)、變形性小的微管路作為液滴培養(yǎng)的容器，實(shí)現(xiàn)硬質(zhì)芯片與透氣培養(yǎng)管路的有機(jī)結(jié)合，成功解決了微生物微液滴培養(yǎng)的難題。液滴在系統(tǒng)運(yùn)行過(guò)程中，不斷往復(fù)于培養(yǎng)管路之中，進(jìn)而充分滿(mǎn)足培養(yǎng)過(guò)程中氣體交換的需求。

 液滴分割融合

微生物的傳代培養(yǎng)操作中，需要將培養(yǎng)到一定階段的菌懸液取出一部分，接種到新培養(yǎng)基中，繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在本研究需要實(shí)現(xiàn)將已培養(yǎng)的微生物微液滴向新培養(yǎng)基液滴中接種菌液，實(shí)現(xiàn)基于微液滴的微生物傳代培養(yǎng)操作。傳統(tǒng)的液滴分割融合方式常常利用芯片結(jié)構(gòu)對(duì)已培養(yǎng)的所有母液滴進(jìn)行分割，生成兩個(gè)子液滴，其中一個(gè)子液滴則直接從廢液口排出，待所有液滴完成分割后，再將所有待利用的子液滴與新培養(yǎng)基液滴進(jìn)行融合，從而完成液滴的微生物傳代。但在對(duì)已培養(yǎng)的母液滴進(jìn)行分割處理中，往往存在液滴的識(shí)別和驅(qū)動(dòng)過(guò)程誤差，造成液滴切割融合的精確性下降，而長(zhǎng)期多次操作會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致單次操作誤差的累積，造成最終的液滴體積差異過(guò)大，穩(wěn)定性差等問(wèn)題。另外，如果分割后的子液滴體積較小，則其在往復(fù)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中容易發(fā)生相互融合，影響系統(tǒng)穩(wěn)定性。如何能夠精確實(shí)現(xiàn)液滴分割融合操作、避免誤差累積、降低液滴之間融合風(fēng)險(xiǎn)、提高系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定性成為液滴傳代操作的關(guān)鍵。為解決液滴分割融合誤差的問(wèn)題，本研究創(chuàng)造性地提出“掐頭去尾”式的液滴分割融合新方法(圖 4C)，即液滴經(jīng)過(guò)識(shí)別點(diǎn)時(shí)，液滴體積的大部分停留在注入通道中，通過(guò)推動(dòng)主通道中油相流動(dòng)，對(duì)駐留液滴暴露在主通道中的小部分頭部體積部分進(jìn)行切割，將液滴分割成兩部分，頭部液滴部分被推入廢液通道，另一部分則停留在駐留通道中；此時(shí)，將新培養(yǎng)基液滴推動(dòng)至液滴注入通道口處，然后將被切割液滴定量進(jìn)入新液滴，再次推動(dòng)融合后的液滴離開(kāi)注入通道口，而殘余的液滴尾部則也被推入至廢液中。同時(shí)，這種巧妙的液滴操作方式，使得液滴的分割和融合過(guò)程緊密相連，避免了小體積液滴長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行而可能造成的相互融合，極大提高了微液滴系統(tǒng)運(yùn)行的穩(wěn)定性。

液滴分選

液滴從生成開(kāi)始，通過(guò)液滴識(shí)別系統(tǒng)對(duì)每個(gè)液滴進(jìn)行編號(hào)，每個(gè)液滴的所有檢測(cè)數(shù)據(jù)都會(huì)與對(duì)應(yīng)編號(hào)的液滴進(jìn)行匹配，因此在分選操作實(shí)施前，液滴經(jīng)過(guò)識(shí)別點(diǎn)進(jìn)行編號(hào)識(shí)別，根據(jù)培養(yǎng)過(guò)程微液滴OD檢測(cè)數(shù)據(jù)，如果是所需液滴，就會(huì)通過(guò)閥口，收集至收集管中，如果是廢棄液滴則被推入下游管路，繼續(xù)下一個(gè)液滴的分選處理(圖 4D)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)微生物微液滴的分選。

芯片集成化設(shè)計(jì)

在實(shí)現(xiàn)微液滴發(fā)生、培養(yǎng)、分割融合、監(jiān)測(cè)、分選的基礎(chǔ)之上，本研究對(duì)這些功能結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)集成，形成了功能完備的集成化微流控芯片系統(tǒng)(圖 5)。其中2號(hào)、4號(hào)、6號(hào)與進(jìn)樣瓶相連，分別用以盛放種子液、新鮮培養(yǎng)基、化學(xué)因子母液。1號(hào)、3號(hào)、5號(hào)均是油相通道，直接與注射泵相連。1號(hào)、3號(hào)管路為長(zhǎng)度為2 m的透氣性良好的AF-2400材質(zhì)管路(內(nèi)徑=1 mm，外徑=1.6 mm)，液滴在兩者之間進(jìn)行往復(fù)運(yùn)動(dòng)。廢液管與閥相連，用以排出廢液。芯片中的液滴識(shí)別點(diǎn)、光譜檢測(cè)點(diǎn)則分別作為液滴識(shí)別窗口和光譜檢測(cè)窗口。芯片系統(tǒng)整體置于恒溫控制倉(cāng)中，保證微生物培養(yǎng)提供所需的最適溫度。

集成化微流控芯片系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖

液滴微流控技術(shù)因生成的液滴體積小、通量高、質(zhì)能交換快、可獨(dú)立操作等特性為微生物研究提供了新方法，但其操作要求高、影響因素多、缺乏自動(dòng)化集成等問(wèn)題限制了該技術(shù)的應(yīng)用推廣。本研究針對(duì)上述關(guān)鍵難題，通過(guò)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)液滴識(shí)別功能模塊、液滴檢測(cè)模塊、進(jìn)樣模塊以及芯片模塊等，將液滴的發(fā)生、培養(yǎng)、檢測(cè)、分割、融合、分選等多種復(fù)雜操作進(jìn)行有機(jī)集成，成功研制出了一款全自動(dòng)高通量微生物微液滴培養(yǎng)系統(tǒng)(MMC)，形成了小型化、自動(dòng)化、高通量的微生物培養(yǎng)系統(tǒng)，并且操作簡(jiǎn)單，運(yùn)行穩(wěn)定。相比于傳統(tǒng)的微生物高通量培養(yǎng)裝備，MMC具有物料消耗少、操作簡(jiǎn)單、在線(xiàn)檢測(cè)(OD和熒光)、數(shù)據(jù)采集密度大、普適性強(qiáng)等多種優(yōu)勢(shì)。

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