4、探針的制備技術(shù)

探針（探針的功能是識別靶序列和攜帶報告分子，如同位素、熒光、地高辛等）：為了提高監(jiān)測靈敏度，人們的努力放在信號放大以及模板擴增兩個方面，其中應(yīng)用經(jīng)過特殊處理的探針方法可以提高靈敏度的方法有三種：分支探針這種方法的原理是，設(shè)計具有龐大分支結(jié)構(gòu)的分支核苷酸探針，分支末端以酶標(biāo)記。這樣，經(jīng)過分支核苷酸與酶的雙重放大作用而將標(biāo)本雜交時極弱的信號轉(zhuǎn)換為較強的化學(xué)信號。分子信標(biāo)（Molecular beacon, MB，一種設(shè)計巧妙的熒光標(biāo)記的核酸探針，未雜交狀態(tài)下為發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在發(fā)夾的兩端分別連接熒光素分子和猝滅分子，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理（FRET））、肽核酸（Peptide nucleic acids, PNA，以中性酰胺鍵為骨架，不帶電荷，為DNA類似物。與DNA的親和性高、酶解穩(wěn)定性好，因此多用來做診斷和檢測用探針）探針3項技術(shù)。

5、雜交反應(yīng)及過程控制技術(shù)

芯片雜交是DNA芯片技術(shù)中除DNA方陣構(gòu)建外最重要的一步。雜交時選擇的條件要使成千上萬對的雜交反應(yīng)中的最大多數(shù)處于最佳狀態(tài)中，也就是說要使得盡可能多的正確配對物都不遺漏（假陰性盡可能少），有錯配的雜交降低至最低（假陽性盡量少），這是非常難以達到的境界。目前雜交是提高芯片在實際應(yīng)用中的準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟之一。雜交條件的構(gòu)建要根據(jù)芯片的實際情況進行最優(yōu)化。

雜交反應(yīng)是一個復(fù)雜的過程，受很多因素的影響，而雜交反應(yīng)的質(zhì)量和效率直接關(guān)系到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。這些影響因素包括：（1）寡核苷酸探針密度的影響。低覆蓋率使雜交信號減弱，而過高的覆蓋率會造成相鄰探針之間的雜交干擾。（2）支持介質(zhì)與雜交序列間的間隔序列長度的影響。研究表明當(dāng)間隔序列長度提高到15個寡核苷酸時雜交信號顯著增強。有研究表明，選擇合適長度的間隔序列，可使雜交信號增強150倍。（3）雜交序列長度的影響。在雜交反應(yīng)中經(jīng)常發(fā)生堿基錯配現(xiàn)象，區(qū)分正常配對的互補復(fù)合物與單個或2個堿基的錯配形成的復(fù)合物，主要依賴于形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性不同，而雜交序列的長度是影響復(fù)合物穩(wěn)定性的一個重要因素，一般說來，短的雜交序列更容易區(qū)分堿基的錯配，但復(fù)合物的穩(wěn)定性要差一些；而長雜交序列形成的復(fù)合物穩(wěn)定，而區(qū)分堿基錯配能力要差一些。研究表明，12、15、20個堿基產(chǎn)生的雜交信號強度接近，但15個堿基的雜交序列區(qū)分錯配堿基效果最好。（4）GC含量的影響。GC含量不同的序列其復(fù)合物的穩(wěn)定性也不同。（5）探針濃度的影響。以凝膠為支持介質(zhì)的芯片，提高了寡核苷酸的濃度，在膠內(nèi)進行的雜交更象在液相中進行的雜交反應(yīng)，這些因素提高了對錯配堿基的分辨率，同時也提高了芯片檢測的靈敏度。（6）核酸二級結(jié)構(gòu)的影響。在使用凝膠作為支持介質(zhì)時，單鏈核酸越長，則樣品進入凝膠單元的時間越長，也就越容易形成鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)從而影響其與芯片上探針的雜交，因而樣品制備過程中，對核酸的片段化處理，不僅可提高雜交信號的強度，還可提高雜交速度。

6、雜交圖譜的信號檢測技術(shù)

雜交圖譜的信號檢測是生物芯片的兩個關(guān)鍵技術(shù)之一，目前關(guān)于芯片的大量專利和研究集中在這方面。熒光檢測主要有2種：激光共聚焦熒光顯微掃描和CCD熒光顯微照相檢測。前者檢測靈敏度、分辨率均較高，但掃描時間長；后者掃描時間短，但靈敏度和分辨率不如前者。雖然熒光檢測在芯片技術(shù)中得到了廣泛的應(yīng)用，但是熒光標(biāo)記的靶DNA只要結(jié)合到芯片上就會產(chǎn)生熒光信號，而目前的檢測系統(tǒng)還不能區(qū)分來自某一位點的熒光信號是由正常配對產(chǎn)生的，還是單個或2個堿基的錯配產(chǎn)生的，或者兼而有之，甚或是由非特異性吸附產(chǎn)生的，因而目前的熒光檢測系統(tǒng)還有待于進一步完善與發(fā)展。有研究者正試圖繞過熒光標(biāo)記，建立新的檢測系統(tǒng)，以提高雜交信號檢測的靈敏度。

比較成熟的是采用激光系統(tǒng)掃描儀進行的熒光檢測，噪音水平、信噪比、分辨率是衡量掃描儀工作質(zhì)量的幾個重要指標(biāo)。由于熒光標(biāo)記法的靈敏度相對較低，因此質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光和光導(dǎo)纖維、二極管方陣檢測、乳膠凝集反應(yīng)、直接電荷變化檢測等等正作為新的芯片標(biāo)記和檢測方法處于研究和試驗階段，其中最有前途的當(dāng)推質(zhì)譜法。

目前有很多廠商生產(chǎn)生物芯片信號檢測掃描儀，知名的公司包括：Genomic Solutions公司、Packard公司、GSI公司、Molecular Dynamics、Genetic aMicrosystems公司、Axon Instruments公司等。其中GSI Lumonics 公司ScanArray 系列一直是生物芯片掃描檢測系統(tǒng)中的領(lǐng)頭產(chǎn)品。2000年GSI并入著名的Parkard公司后ScanArray的軟、硬件都得到進一步加強。

7、信號（信息）分析與解讀——數(shù)據(jù)分析

芯片雜交圖譜的多態(tài)性處理與存儲都由專門設(shè)計的軟件來完成。一個完整的生物芯片配套軟件應(yīng)包括生物芯片掃描儀的硬件控制軟件、生物芯片的圖像處理團建、數(shù)據(jù)提?。?/span>mining）或統(tǒng)計分析軟件，芯片表達基因的國際互聯(lián)網(wǎng)上檢索和表達基因數(shù)據(jù)庫分析和積累。

從國際上生物芯片專利的按領(lǐng)域分布來看，62%的專利集中在數(shù)據(jù)分析領(lǐng)域，可見如何對生物芯片帶來的海量數(shù)據(jù)進行解讀、分析是生物芯片研究領(lǐng)域的焦點和重點。

對所讀取的數(shù)據(jù)的處理方面，目前已經(jīng)有許多數(shù)學(xué)統(tǒng)計的方法用于芯片數(shù)據(jù)處理與信息提取，應(yīng)用最廣泛的是聚類分析（cluster analysis）、此外還有主成分分析(principal component analysis)、時間序列分析(time series analysis)等，但是還沒有一種最標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)計方式。

免責(zé)聲明：文章來源網(wǎng)絡(luò) 以傳播知識、有益學(xué)習(xí)和研究為宗旨。 轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請聯(lián)系刪除。