染色質(zhì)免疫沉淀后測序(ChIP seq)是一種針對DNA結(jié)合蛋白、組蛋白修飾或核小體的全基因組分析技術(shù)。由于二代測序技術(shù)的巨大進(jìn)步，ChIP-seq比其最初版本ChIP-chip具有更高的分辨率、更低的噪聲和更大的覆蓋范圍。隨著測序成本的降低，ChIP- seq已成為研究基因調(diào)控和表觀遺傳機制不可或缺的工具。

1. 原理  

甲醛處理細(xì)胞使目標(biāo)蛋白與DNA交聯(lián)，通過超聲波將交聯(lián)后的染色質(zhì)打斷成小片段，一般在200-600bp范圍內(nèi)。再利用抗原抗體的特異性識別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來。最后，去交聯(lián)并對純化后DNA進(jìn)行PCR擴增，高通量測序，最后與已有基因組序列進(jìn)行比對，以確定 DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合的序列。

2.問題分析

2.1.甲醛交聯(lián)對后續(xù)結(jié)果分析的影響？

自從Orlando V等人首次發(fā)明了ChIP技術(shù)，十幾年后核心步驟仍無大變化。然而，ChIP-seq技術(shù)實際存在一定的缺陷，例如甲醛交聯(lián)。甲醛雖然是一種高度滲透的交聯(lián)劑，但由于其反應(yīng)活性僅限于胺，因此其交聯(lián)效率較低；對哺乳動物細(xì)胞而言，其最大交聯(lián)效率僅為1%。因此甲醛交聯(lián)細(xì)胞所需的起始量很大，也因此該技術(shù)也很難適用于微量細(xì)胞及單細(xì)胞樣本。牛津大學(xué)出版社發(fā)表的文章In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis指出，某些蛋白質(zhì)如：阻遏蛋白，NF-κB等無法通過甲醛交聯(lián)到DNA上，研究表明；在DNA上的停留時間短于5秒的蛋白質(zhì)無法用甲醛交聯(lián)。其次，甲醛會導(dǎo)致許多其它無關(guān)蛋白質(zhì)交聯(lián)到DNA上，影響后續(xù)分析數(shù)據(jù)。有報道稱，甲醛交聯(lián)會觸發(fā)DNA損傷應(yīng)答機制，從而改變?nèi)旧w組分，進(jìn)而使ChIP結(jié)果產(chǎn)生偏向性。除此之外，由于交聯(lián)反應(yīng)在加熱和低PH的情況下會發(fā)生逆轉(zhuǎn)，因此DNA蛋與白質(zhì)的交聯(lián)復(fù)合物的穩(wěn)定性也是一個值得關(guān)注的問題。因此，甲醛究竟在多大程度上能反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分布仍不能確定。

根據(jù)有無甲醛交聯(lián)步驟可以把CHIP技術(shù)劃分為兩種類型，一類是存在甲醛交聯(lián)的 ChIP，即X-ChIP（cross-linking and mechanical shearing ChIP）；另一類是無交聯(lián)存在的ChIP，即N-ChIP（native-ChIP）；相較于X-ChIP，N-ChIP技術(shù)有一系列的優(yōu)點，包括：高分辨率（MNase的使用使得染色體的片段化可以小至核小體）、避免了甲醛交聯(lián)帶來的非特異性蛋白在DNA上的富集、避免了甲醛交聯(lián)對抗原表位的遮蓋、步驟的減少降低了樣品的損失等。然而，由于使用了MNase，N-ChIP只適用于研究組蛋白修飾，大部分情況下不能用于轉(zhuǎn)錄因子的研究。

2.2. 超聲波打斷和酶斷裂方法的比較？

酶類：最常用的酶類如MNase，即：微球菌核酸酶，是一種能降解核小體連接區(qū)的DNA序列的核酸酶，最初從金黃色葡萄球菌中分離出來。MNase消化染色質(zhì)可以釋放出一個個獨立的核小體。

MNase酶解法具有一定的局限性，首先，MNase對于偏向于切割A(yù)/T堿基位點，導(dǎo)致核小體在A/T富集區(qū)域的表達(dá)量低于真實情況；其次，MNase不能在核小體邊界精確切割，這導(dǎo)致在確定染色質(zhì)的開放位置與真實情況存在差異；而且，MNase偏向于消化脆性核小體。在不同物種的實驗證據(jù)表明，脆性核小體占據(jù)了基因啟動子和轉(zhuǎn)錄終止位點，而脆性核小體只在MNase濃度較低且消化時間較短的情況下才能被檢測出來，因此很難將脆弱核小體量化到穩(wěn)定核小體的相對豐度。

超聲打斷則不如酶裂解法溫和，而且由于打斷的不均勻性，導(dǎo)致測序結(jié)果背景噪音高，影響后續(xù)數(shù)據(jù)分析。由于文章篇幅限制，在此不多贅述。

那么究竟選擇酶解還是超聲打斷，需要視情況而定?？蓞⒖家韵陆ㄗh：

如果所研究的蛋白質(zhì)高豐度表達(dá)且與DNA結(jié)合緊密如組蛋白，那么樣本無需需交聯(lián)，這時可使用酶解法。

如果所研究的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度較低或與DNA結(jié)合不緊密如轉(zhuǎn)錄因子等，往往需要用交聯(lián)試劑將樣本進(jìn)行固定，穩(wěn)定蛋白質(zhì)和DNA的形態(tài)，這時最好選用超聲法進(jìn)行斷裂。

3.拓展  

3.1適用于微量細(xì)胞水平的ChIP技術(shù)及其原理

（1）CUT-Tag技術(shù)

CUT-Tag可同時用于研究轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點以及DNA的開放性。可在一天之內(nèi)完成從細(xì)胞到建庫完成的所有步驟，且具有高分辨率，低噪音等特點。起始細(xì)胞用量可低至50個。

原理

利用抗原抗體特異性反應(yīng)，加入特異性抗體與染色體上目標(biāo)蛋白結(jié)合，加入二抗與該抗體結(jié)合以募集更多的pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶復(fù)合物至目標(biāo)蛋白與DNA序列的結(jié)合位點上，轉(zhuǎn)座酶復(fù)合物切割該染色質(zhì)開放位點，并在切割后的DNA片段兩端加入接頭，文庫構(gòu)建完成，可直接進(jìn)行后續(xù)測序，與已有基因組序列比對，即可知道目標(biāo)蛋白與DNA的結(jié)合位點。

（2）ChIL-seq

ChIL（chromatin integration labelling），即染色質(zhì)集成標(biāo)簽技術(shù)，可同時用于研究轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點以及DNA的開放性，起始細(xì)胞用量為100-1000個細(xì)胞。ChIL-seq 避免了傳統(tǒng)ChIP-seq技術(shù)中由于抗體沉淀所帶來的回收率低的缺陷，尤其適用于貼壁細(xì)胞。對于活躍的組蛋白標(biāo)記如H3K4me3 ，H3K27ac，起始細(xì)胞用量甚至可降低至單細(xì)胞水平。

原理

在96孔板中加入細(xì)胞，經(jīng)固定，染色后加入一抗與目標(biāo)蛋白結(jié)合，隨后加入ChIL探針（由二抗和ChIL DNA組成），探針中的ChIL DNA經(jīng)Tn5轉(zhuǎn)座酶整合到目標(biāo)蛋白所在基因組DNA附近，隨后T7 RNA 聚合酶經(jīng)ChIL DNA中的啟動子啟動轉(zhuǎn)錄，以此處基因組DNA為模板合成RNA，經(jīng)DNase I消化和裂解釋放RNA，以純化的RNA建庫測序。

（3）Drop-ChIP

Drop-ChIP:使用了特定的微流控裝置，分辨率可達(dá)到單細(xì)胞水平。該技術(shù)不僅可以在單細(xì)胞水平研究轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點及組蛋白修飾，還可以從細(xì)胞特異性角度研究不同細(xì)胞間染色質(zhì)的變異程度。我們認(rèn)為，整合單細(xì)胞染色質(zhì)和單細(xì)胞表達(dá)數(shù)據(jù)，可以使調(diào)控元件與靶基因更精確地耦合，并更深入地了解它們的功能動力學(xué)和關(guān)系。

原理

首先，將待研究的細(xì)胞與裂解液，MNase混合進(jìn)行染色質(zhì)消化，另外設(shè)計一個包含很多種不同接頭的液滴，在微流控裝置上反應(yīng)，使得每一個細(xì)胞液滴與一種接頭液滴混合，同時與含有DNA連接酶的buffer液滴混合。這個過程中，接頭序列自動連接到裂解的染色質(zhì)片段兩端，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞裂解，使用特異性抗體對目標(biāo)蛋白進(jìn)行沉淀，對富集后的DNA進(jìn)行測序。與已有基因組序列比對即可知道目標(biāo)蛋白作用位點。

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