所有的活組織都是由細胞組成的。為了研究細胞，科學家們將它們從原始組織中分離出來，并在受控和人造的環(huán)境中培育它們：這就是所謂的細胞培養(yǎng)。它于1907年首次使用，并在生物醫(yī)學實驗室中無處不在。細胞研究已經(jīng)從在2D表面上進行演變?yōu)?/span>3D配置，以更接近地模擬人體內(nèi)自然的3D棲息地：這就是我們所說的3D細胞培養(yǎng)。

圖1  細胞療法或再生醫(yī)學

1.三維細胞培養(yǎng)的目的

細胞療法或再生醫(yī)學，它包括生長在患者體內(nèi)的細胞以修復(fù)受損組織。該領(lǐng)域包括幾個研究領(lǐng)域，如圖1所示。

用于藥物發(fā)現(xiàn)的3D 體外模型，其目的在于創(chuàng)建模擬活組織的3D細胞模型，以使大部分研究和藥物發(fā)現(xiàn)可以在體外而不是在動物（或人類）上完成。如圖2所示，3D體外模型旨在用于臨床試驗之前藥物發(fā)現(xiàn)的不同階段。

需要指出的是，細胞培養(yǎng)的另一個基本目標通常是使用細胞產(chǎn)生病毒或抗體。然而，傳統(tǒng)上這是通過二維細胞培養(yǎng)實現(xiàn)的，除了提高產(chǎn)量外，沒有什么需要向真正的三維細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)變。

圖2 用于藥物發(fā)現(xiàn)的3D 體外模型

Allied Market的研究估計，截至2015年，全球3D細胞市場為7.65億美元，預(yù)計2022年將增長30％至469.9億美元 [4]。他們將市場分為四類：藥物發(fā)現(xiàn)，癌癥研究，再生醫(yī)學和干細胞研究。根據(jù)我們更廣泛的分類，我們認為干細胞研究的一部分與再生醫(yī)學一起參與細胞治療。這是因為干細胞可以在體外分化成所需的細胞類型并被重新植入以修復(fù)組織。另一方面，我們認為，雖然癌癥和干細胞研究是他們自己的主要參與者，但他們在開發(fā)3D體外模型方面發(fā)揮了重要作用。因此，我們發(fā)現(xiàn)大部分市場有助于藥物發(fā)現(xiàn)的3D體外建模（圖3）。這在很大程度上是由于癌癥研究的一個重大推動，而癌癥研究本身就是世界范圍內(nèi)癌癥發(fā)病率上升。

2.三維細胞培養(yǎng)的種類

微芯片、生物反應(yīng)器、水凝膠等。

3.誰對3D細胞培養(yǎng)感興趣？

從地理位置上看，Allied Market Research估計2015年美國是三維細胞市場中最大的演員，占市場的41％，而歐洲占29％，亞太占19％，巴西，南非和沙特阿拉伯占11％（圖5）。2022年，他們估計美國和歐洲在市場上的重要性之間的差距將會減小，美國的貢獻率為35.3％，其次是歐洲的31.5％。

  三種主要類型的終端用戶參與3D細胞培養(yǎng)市場：生物技術(shù)和制藥公司，學術(shù)實驗室和合作研究實驗室。

4.為什么要多加一個第三維？

答案很簡單：因為在正常的環(huán)境中，細胞在三維空間中演化！現(xiàn)在確定細胞在3D中的表現(xiàn)與2D相比有很大不同。當3D中的細胞顯示出與2D中的細胞不同的反應(yīng)時，這證明3D培養(yǎng)細胞用于藥物測試至關(guān)重要。

簡而言之，在3D中培養(yǎng)細胞允許細胞采用類似于體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的形態(tài)學和遷移模式。重新形成細胞的正常形態(tài)是重要的，因為它們的形狀可以直接影響它們的生物活性[8]。由于細胞遷移是許多疾病（如癌癥）中的一個中心過程，可以以藥理學為靶點，因此在體外忠實地復(fù)制遷移模式也很重要。一般來說，將細胞放置在3D中有效地增加了它們與其周圍環(huán)境的相互作用程度。它迫使它們在整個表面區(qū)域與它們的微環(huán)境（無論是支架，水凝膠還是其他細胞）進行更大程度的相互作用，就像它們在組織中所做的那樣。這是至關(guān)重要的，因為現(xiàn)在已知細胞與其ECM和微環(huán)境的相互作用對許多細胞功能是必不可少的[7-9]。另外，3D支持系統(tǒng)提供物理和生物化學錨定，可以被設(shè)計為在體內(nèi)復(fù)制條件。構(gòu)成細胞外基質(zhì)的剛度，孔徑或配體可以被微調(diào)以模擬感興趣的組織。最后，3D細胞培養(yǎng)允許形成和研究更復(fù)雜的多細胞結(jié)構(gòu)，例如球體，類器官或微血管。

5.用于藥物發(fā)現(xiàn)的3D體外模型

問題：藥物發(fā)現(xiàn)過程中真正的瓶頸

發(fā)現(xiàn)了一種在實驗室中成功治療疾病的藥物！這是一個里程碑。這通常意味著你已經(jīng)在小鼠身上研究了藥物?，F(xiàn)在，您需要決定是否要花費大量的時間和金錢來通過嚴格的法規(guī)和更多的臨床前測試，直到您的藥物可以在人體臨床試驗中進行測試。只有發(fā)現(xiàn)......什么也不做，更糟的是，無法預(yù)料的副作用。

這是目前藥物發(fā)現(xiàn)過程的悲傷現(xiàn)實：在小鼠中使用的10種藥物中約有9種不在人體中 （圖7）。這些統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，問題很可能在于臨床前模型的預(yù)測能力：我們需要更好地重述人類對藥物反應(yīng)的模型。特別是認為主要問題在于未能預(yù)測藥物的療效及其毒性。這是目前制藥行業(yè)面臨的巨大瓶頸。想象一下平均10年的花費和26億美元的無花果。仍然想知道為什么我們目前還沒有輕易治愈所有重大疾??？

我們需要重新考慮藥物發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)，以便更有選擇性地過濾最終對人類起作用的藥物。其目的提高藥物發(fā)現(xiàn)過程的成功率，提高產(chǎn)量并降低相關(guān)成本。

不用說，新的試劑不能直接在人體上測試，事先沒有證據(jù)證明其潛在的毒性。相反，科學家傳統(tǒng)上一直使用替代模型來預(yù)測藥物在人類中的作用，例如動物或細胞模型，各有利弊（圖8）。請注意，圖8中列出的大多數(shù)優(yōu)點和缺點適用于整個體外模型，即2D和3D蜂窩系統(tǒng)。

利用動物模型的主要優(yōu)勢是無與倫比的。這意味著不僅可以評估藥物對細胞的局部影響（就像您在典型的簡單細胞研究中那樣），還可以評估其對整個身體（換句話說，對于多個器官）的系統(tǒng)影響。同樣，現(xiàn)在越來越明顯，細胞的微環(huán)境不僅影響細胞的生理機制，而且影響它們對藥物的反應(yīng)[42]：因此，能夠研究藥物在動物中的作用是有利的，細胞類型正在實時交互。

雖然眾多強大的老鼠模型已經(jīng)被描述，但它們的一些內(nèi)在限制將難以克服。例如，動物的結(jié)果固有地基于非人類細胞和病原體，其可能不能完全地模擬人類藥理學反應(yīng)。雖然研究已將人類細胞引入小鼠，但通常必須在免疫系統(tǒng)受損的小鼠中進行以防止人類細胞排斥。這反過來意味著動物模型不能正確反映免疫細胞的作用，應(yīng)該考慮到這一點，因為很明顯免疫細胞是許多疾病的關(guān)鍵演員。在任何情況下，小鼠中引入的人類細胞都與鼠源的細胞微環(huán)境相互作用，這可能不能正確反映患者中發(fā)生的全人體細胞相互作用。相反，細胞研究可以完全由人類細胞組成。這避免了將動物結(jié)果外推到人體所造成的差異，這對免疫系統(tǒng)來說尤其明顯。盡管細胞模型仍未能總是預(yù)測人類對藥物的正確反應(yīng)，但三維細胞培養(yǎng)領(lǐng)域仍處于起步階段，并且正在迅速發(fā)展; 因此可能比動物模型更適合填補臨床前預(yù)測模型中的當前缺口。事實上，許多新興的3D細胞培養(yǎng)產(chǎn)品已經(jīng)在藥物發(fā)現(xiàn)過程中實施。傳統(tǒng)上，三維器官芯片已廣泛用于學術(shù)環(huán)境中的疾病建模。他們現(xiàn)在也正在轉(zhuǎn)向更多的藥理學應(yīng)用，如藥物篩選，毒性和藥代動力學檢測。3D細胞培養(yǎng)也可以大大推進細胞治療領(lǐng)域。

6.細胞療法

細胞療法的目標是替換患者損傷或衰竭器官的組織。為了實現(xiàn)這一目標，在進行基礎(chǔ)體外研究和開發(fā)用于使細胞最終植入患者體內(nèi)的方案方面作出了巨大努力，使用各種3D細胞培養(yǎng)產(chǎn)品。

支架裝載細胞并最終植入患者體內(nèi)以局部再生目標組織。

三維支架可放置在生物反應(yīng)器內(nèi)以促進三維細胞的研究，優(yōu)化組織生長并預(yù)測植入物在植入后的機械響應(yīng)。這在生物反應(yīng)器中得到了獨特的促進，因為它們能夠?qū)ε囵B(yǎng)環(huán)境提供如此嚴格的控制，并且能夠?qū)M織進行物理調(diào)節(jié)，以模擬細胞在移植后會發(fā)生的作用力[2]。傳感器通常集成在生物反應(yīng)器中，這有助于建立計算模型并獲得精確的實驗數(shù)據(jù)，以預(yù)測細胞對其植入體內(nèi)的反應(yīng)。

可以向患者注射   干細胞以促進組織特異性再生。有趣的是，已經(jīng)表明與3D中的培養(yǎng)相比，3D中的生長干細胞具有臨床益處。例如，在3D中擴展球體中的間充質(zhì)干細胞增強了它們在小鼠移植后的抗炎反應(yīng)[15]。干細胞的球體也被用于提高臨床試驗中干細胞生產(chǎn)的產(chǎn)量。

類固醇是由干細胞或器官祖細胞體外發(fā)育而來的，它們自我組織成類似于器官的基本顯微解剖結(jié)構(gòu)[16]。因此，人們認為他們有朝一日可以成為替代某些器官的移植來源。到今天為止，復(fù)制腎臟或冒號的類器官已經(jīng)移植到小鼠身上，并且長期植入成功。

可以使用3D打印器官進行移植，而不是使用自組裝的類器官。雖然我們遠不能印刷整個器官的精確復(fù)制品，但已經(jīng)成功地植入動物和人體中的膀胱，氣管，骨和軟骨的生物印刷品[17]。

最后，雖然微流體芯片往往與建立3D體外模型更相關(guān)，但是一些微流體工具已經(jīng)被開發(fā)用于將細胞包封在3D ECM中，其可以植入患者體內(nèi)。一項研究使用微流體裝置來制造水凝膠微纖維，然后將其用于在小鼠中包封和植入胰島。

7.微流控

微流控技術(shù)依賴于使用10-100微米高度或?qū)挾鹊男⊥ǖ纴硖幚硇◇w積流體。它們與傳統(tǒng)的3D細胞模型的關(guān)鍵特點是它們能夠更好地控制細胞，物理和生物化學微環(huán)境。這使得研究人員能夠模仿更全面的人體組織的復(fù)雜細胞模型[23]。

微流控芯片的設(shè)計可以由許多不同的通道或隔室組成，可以很容易地滿足研究人員的需求。這種區(qū)室化允許在生理長度尺度上對細胞分布進行獨特的空間控制，特別是對于不同細胞類型的共培養(yǎng)。現(xiàn)在許多微芯片已經(jīng)將電子和機械致動器（例如閥門或開關(guān)）集成到微芯片上，從而有助于在同一芯片上實現(xiàn)多個連續(xù)步驟。這個概念通常被稱為芯片實驗室（lab-on-a-chip）：許多耗時的實驗室任務(wù)可以微型化并自動化集成到微流控芯片上。與傳統(tǒng)的宏觀測定相比，這種小型化還減少了所需的試劑和細胞的消耗，這降低了成本。

通道的存在允許在尺度上控制流量。這有助于跨越通道形成化學或物理梯度（例如細胞因子梯度或間質(zhì)壓力），這在許多生物過程中是重要的。

微流控芯片中的細胞與顯微鏡物鏡之間的短距離能夠以比其他傳統(tǒng)宏觀體外系統(tǒng)更高的分辨率成像整個樣品。

微芯片 存在一些重要的限制：主要的是如果需要進行后續(xù)測試，則細胞難以檢索。另外，即使它們被檢索到，大小也可能不足以用于后續(xù)測試。然而這些挑戰(zhàn)正在逐漸在克服，以適應(yīng)3D細胞培養(yǎng)市場的需求。

8.顯微鏡下3D細胞培養(yǎng)的未來

為了跟上藥物發(fā)現(xiàn)和細胞治療市場日益增長的需求，3D細胞培養(yǎng)面臨著許多挑戰(zhàn)。

第一個是可重復(fù)性：通常，3D細胞培養(yǎng)結(jié)果太可變。這種可變性的來源是三個方面。第一個是生物。眾所周知，細胞和細胞衍生的產(chǎn)物（如Matrigel或血清）在不同批次的生產(chǎn)中是不同的。第二個變異來源是基于用戶的：與3D細胞培養(yǎng)相關(guān)的許多程序如移液是手動完成的，因此容易受到用戶依賴性的變化影響。最后，很多方案可能受環(huán)境因素的影響，這些環(huán)境因素在測定中通常不受局部控制，例如溫度或濕度，這些因素可能會非常影響關(guān)鍵步驟，如3D凝膠聚合。同時，3D細胞培養(yǎng)程序遠非易事。他們需要專業(yè)和訓(xùn)練有素的工作人員長。另外，這些任務(wù)耗時且成本高昂。

這些問題都指向了3D細胞培養(yǎng)領(lǐng)域的兩大需求：自動化和標準化。理想情況下，需要新產(chǎn)品來促進這些三維細胞培養(yǎng)過程，并減少人為干預(yù)，以最大限度地減少人為錯誤，加快并提高吞吐量和再現(xiàn)性。目前，細胞傳代或細胞擴增等任務(wù)的自動化正在進行中[2]。

3D細胞培養(yǎng)領(lǐng)域的另一個主要瓶頸是缺乏簡單的讀數(shù)。太多的研究都嚴重依賴3D成像來分析細胞形態(tài)，遷移或生存能力。這需要大量的時間，并需要使用昂貴的專用設(shè)備，如共聚焦顯微鏡。同時，還需要努力使分析方法標準化為了量化這些結(jié)果：重建3D圖像遠非易事。雖然有幾種3D重建軟件包可以在商業(yè)上獲得，但仍然很難定義，提取和量化來自這些復(fù)雜數(shù)據(jù)集的新變量。

微流控技術(shù)已經(jīng)顯示出自動化和簡化繁瑣程序的巨大潛力。例如，一些微流控芯片具有自動化的ELISA方法[28]，并且將質(zhì)譜結(jié)合到微流控芯片上。這最大限度地降低了成本和時間，但也有助于通過最大限度地減少人為干預(yù)來標準化結(jié)果 然而，朝著3D中細胞的操縱方向發(fā)展可能會更困難。雖然在微流控工具中操作流體是常規(guī)操作，但操作和混合不同粘度的溶液（如細胞懸浮液和3D水凝膠）更具挑戰(zhàn)性，因為它需要克服層流。

團隊還發(fā)現(xiàn)了將微流體芯片與簡單讀數(shù)相結(jié)合的方法。例如，Whitesides小組開發(fā)了比色紙基微流控技術(shù)，這樣檢測結(jié)果只是通過顏色變化顯示[29]。微流體芯片還具有促進個性化醫(yī)療的明顯優(yōu)勢。

與此同時，努力開發(fā)具有受控環(huán)境的微流控芯片，就像生物反應(yīng)器一樣。例如，重新創(chuàng)建缺氧環(huán)境的微流體工具已經(jīng)被創(chuàng)造出來以模擬癌組織中的缺氧[30]。在另一項研究中，將微流控芯片連接到壓力控制器上，以便在細胞上施加周期性的壓力和變化，就像在肺部經(jīng)歷的那樣[31]。換句話說，微流控芯片可以成為他們自己的微生物反應(yīng)器，從而獲得生物反應(yīng)器為3D細胞培養(yǎng)提供的許多益處。同時，集成傳感器的微流體正在開發(fā)中[32]，并且很可能在不久的將來變得更加普及。傳感器的存在與生物反應(yīng)器非常相似，可以監(jiān)測重要變量并有助于實現(xiàn)自動化和可追溯性。

微流體技術(shù)實現(xiàn)的自動化，小型化和高精度也將有助于標準化的程序，如細胞分化。事實上，需要分化的細胞如干細胞或單核細胞通常使用常規(guī)的宏觀體外方案進行分化，如果不控制化學和環(huán)境刺激，則可能容易產(chǎn)生大的變異。相反，微流控芯片可以精確控制培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，或氧濃度或流體特性，所有這些都可以影響干細胞的分化[33]。與此同時，這些芯片與蛋白質(zhì)分析等傳感器的結(jié)合使得細胞分化過程中特定線索和信號通路的作用得以解開[34]。

由微流體促成的小型化和自動化提供了從科學中心向更其他方面的繁瑣程序的最終可能性。這已經(jīng)用于測試肝功能的微流體[35]。相反，3D細胞培養(yǎng)的微流體應(yīng)用目前需要許多步驟，只能在實驗室進行。然而，隨著研發(fā)進展，3D細胞培養(yǎng)微流體技術(shù)也可能成為即時診斷方法，如果在偏遠地區(qū)，直接在診所中使用也不是不可能。

獨特的微流控芯片可以使血管結(jié)構(gòu)灌注。簡言之，當內(nèi)皮細胞在適當?shù)?/span>3D凝膠（例如纖維蛋白）中混合時，它們形成血管。雖然這可以以任何形式發(fā)生，但微流控芯片中的容器形成直接連接到微流體通道的開口[36]，[37]。這意味著可以通過微流體通道直接進入血管的血管內(nèi)隔室，使得血管可以被顆粒，細胞或培養(yǎng)基灌注。這對于重新創(chuàng)造許多涉及脈管系統(tǒng)內(nèi)細胞或分子運輸?shù)纳飳W過程或僅僅是為了能夠在脈管系統(tǒng)內(nèi)灌注藥物至關(guān)重要，因為它們將在患者中遞送。另一方面，類器官也可以在微流體芯片中生長以更好地控制其發(fā)展。那是，微流體隔室會限制并因此在一定程度上控制器官形狀和尺寸。最終，可以將類器官與微流體芯片內(nèi)的血管網(wǎng)絡(luò)混合以獲得可灌注的器官型模型，并實現(xiàn)更復(fù)雜的組織模型。最終，將干細胞/類固醇結(jié)合到微流控芯片中意味著能夠使用患者衍生細胞創(chuàng)建個性化的細胞模型[27]。

與此同時，微流控系統(tǒng)在免疫細胞研究中具有獨特的優(yōu)勢，正如其他地方廣泛審查的一樣[23]。這是因為它們允許建立細胞因子梯度，這對免疫細胞是重要的指導(dǎo)線索。微流體模型提供的流量控制對于在血液循環(huán)中重建免疫細胞運輸至關(guān)重要。沿著同樣的路線，先前討論的在微流控芯片上灌注血管的能力對于在血管內(nèi)和血管內(nèi)再生免疫細胞運輸也是獨一無二的，就像它們在體內(nèi)一樣。最后，免疫細胞是高度移動的和異質(zhì)細胞，必須經(jīng)常將其視覺化以作為研究它們的手段。微芯片極大地促進了它們的高分辨率成像以進行詳細分析。

最后，微芯片一直是器官芯片的唯一技術(shù)努力[25]。正如我們之前所討論的，由微芯片提供的對微環(huán)境的增強控制使得該技術(shù)對于開發(fā)器官型模型而言是獨特的。另外，促進流動使得器官之間的連接和相互作用能夠使分子從一個器官轉(zhuǎn)移到另一個器官。這些相互作用已被證明是藥物測試的關(guān)鍵。例如，腸道和肝臟已經(jīng)在芯片上結(jié)合，因為藥物首先通過腸道吸收，然后通過肝臟代謝[38]。他們的組合已被證明影響藥物的命運不同于膽汁肝臟分別培養(yǎng)的芯片[39]。在胃內(nèi)加入胃還可能對模擬胃排空很重要，所有這些都會影響藥物的藥代動力學[40]。

最近，研究人員首次在3D芯片上進行了生物打印 -心臟芯片：這對促進和標準化芯片制造器件顯示出巨大的希望。此外，柔性傳感器被集成在組織的微架構(gòu)中。

總而言之，我們相信微流體技術(shù)為3D細胞培養(yǎng)領(lǐng)域提供了很多可能，如果努力將其潛力從學術(shù)環(huán)境轉(zhuǎn)化為臨床方面。然而，所有這些都需要工程師，生物學家，臨床醫(yī)師，健康監(jiān)管人員之間的合作和努力......